virus del papiloma humano y cáncer: epidemiología y prevención ...

Marta Ortiz Rivera, Montserrat Torres Hortal, Alfredo García Sáiz
Roche Applied Science, Suiza, etc.). El método de extracción de ácidos
nucleicos es un punto crítico, ya que un bajo rendimiento del método utilizado
puede disminuir significativamente la sensibilidad de las técnicas moleculares,
tanto desde el punto de vista de la detección del VPH como del análisis
de infecciones por múltiples tipos del VPH. La comparación de los diferentes
métodos de extracción aplicados al diagnóstico del VPH es compleja debido
a la variedad de protocolos y de sistemas de amplificación descritos en la
bibliografía.
La utilización de controles internos en las reacciones de amplificación,
como la detección de genes constitutivos (ß-globina, ß-actina) para evaluar la
calidad del ácido nucleico extraído, constituye una herramienta de gran utilidad.
La utilización de muestras de archivo, generalmente tejidos incluidos en
parafina, es importante para la realización de estudios retrospectivos. Sin
embargo, el proceso de fijación puede afectar considerablemente a la calidad
de los ácidos nucleicos. Este tipo de muestras es adecuado para sistemas basados
en la amplificación de pequeños fragmentos de ADN.
5.2.2. Métodos de amplificación de señal
El único sistema basado en esta tecnología para la detección del VPH es el
test de captura de híbridos, comercializado por la empresa Digene
Corporation, utilizando la metodología Hybrid Capture® (hc). Esta prueba en
la actualidad está disponible en dos formatos. El formato hc2 HPV DNA Test
incluye dos mezclas de sondas, una para la detección de 13 tipos de VPHs de
alto riesgo (VPHs 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) y otra para
la detección de 5 tipos de bajo riesgo (VPHs 6, 11, 42, 43, 44). El ensayo puede
realizarse con la sonda de bajo riesgo y/o de alto riesgo. Por su parte, el formato
hc2 High Risk DNA Test incluye sólo la mezcla de sondas para la detección
de los 13 tipos de VPHs de alto riesgo. Esta metodología fue aprobada por la
Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos en el año 2003.
La Figura 5.2 muestra de forma esquemática el principio de la técnica, que
incluye los siguientes pasos:
• Desnaturalización de las muestras biológicas con el ADN diana.
• Hibridación con mezclas de sondas ARN, dando lugar a la formación de
híbridos de ARN-ADN.
• Estos híbridos son capturados por anticuerpos universales que están unidos
a la fase sólida.
• Los híbridos inmovilizados reaccionan con anticuerpos conjugados con
fosfatasa alcalina, específicos para los híbridos de ADN-ARN.
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