virus del papiloma humano y cáncer: epidemiología y prevención ...

Determinación de VPH: aspectos técnicos
• Imposibilidad de detección de mutaciones puntuales.
• Posible asignación de tipo errónea en determinadas variantes del VPH
con mutaciones puntuales que afecten a las dianas de restricción, lo
cual ha sido descrito, por ejemplo, para las variantes de los tipos 53 y
58.
Secuenciación directa de los productos de PCR
Existen diferentes métodos de secuenciación genómica: unos utilizan
cebadores marcados y otros dideoxinucleótidos marcados que son empleados
en la detección de las secuencias. Este último es el método más ampliamente
utilizado, dado que el marcaje de un elevado número de cebadores aumenta
significativamente el coste de la técnica. Actualmente, el avance en las
técnicas de biología molecular y la disponibilidad de equipos de secuenciación
automáticos, los cuales permiten el procesamiento de un elevado número
de muestras simultáneamente, han simplificado de forma significativa la
metodología de secuenciación.
La asignación del tipo del VPH se puede realizar mediante el análisis de
homología de secuencia con bases de datos internacionales utilizando para
ello diferentes programas informáticos (como por ejemplo el programa BLASTinformación
disponible en la página web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),
o bien mediante el análisis filogenético de la secuencia obtenida con secuencias
de referencia de los distintos tipos del VPH.
El análisis de la secuencia es una tipificación directa e inequívoca que permite
distinguir variantes y polimorfismos virales del VPH, pero no es un método
adecuado para la detección de infecciones múltiples de VPH porque sólo
será detectado el genotipo predominante.
En los últimos años se han desarrollado sistemas basados en secuenciación
que utilizan múltiples cebadores en la reacción de secuencia, permitiendo el
análisis de infecciones múltiples de VPH. Esta metodología requiere la utilización
de equipos de detección específicos, no generalizados en la mayor
parte de los laboratorios.
Hibridación de los productos de PCR
La hibridación de los productos de PCR con sondas específicas es un método
ampliamente utilizado para la detección y tipado del VPH. Se han desarrollado
diferentes formatos de hibridación - tanto en microplaca como en tira -
que facilitan su utilización en la práctica clínica.
La mayoría de los sistemas están basados en el marcaje de los productos
de PCR con biotina durante el proceso de amplificación y la posterior hibridación
con sondas específicas.
97