virus del papiloma humano y cáncer: epidemiología y prevención ...

Marta Ortiz Rivera, Montserrat Torres Hortal, Alfredo García Sáiz
detección a tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo
mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el
ADN de cadena doble como el SYBR ® Green o mediante hibridación con
diferentes tipos de sondas: sondas Taqman, cebadores fluorescentes o
Molecular Beacons y sondas de hidrólisis. La utilización de sondas aumenta
la especificidad de la reacción.
Tanto los sistemas de amplificación del VPH de amplio espectro como los
sistemas específicos de tipo han sido adaptados a PCR en tiempo real. La
identificación de tipos del VPH mediante esta técnica es compleja, ya que
requiere la utilización de diferentes sondas específicas. Diferentes sistemas
basados en esta tecnología están o estarán disponibles en el mercado, si bien
es necesaria una validación adecuada de los mismos.
La detección del ARN viral mediante transcripción inversa (RT-PCR) es una
herramienta que puede ser de gran utilidad desde el punto de vista clínico, ya
que permite evaluar la expresión de los oncogenes del VPH. La empresa
Norchip ha desarrollado un sistema de RT-PCR de VPH -PreTect HPV Prooferque
detecta la expresión de los oncogenes E6/E7 de los tipos de alto riesgo
más frecuentes (VPHs 16, 18, 31, 33 y 45) utilizando la tecnología de amplificación
basada en la secuencia de ácidos nucléicos (NASBA) combinada con
detección a tiempo real.
5.2.4. Métodos de detección de los productos amplificados.
Análisis de los patrones de restricción
Esta metodología, empleada clásicamente en biología molecular para la
caracterización y tipificación de diferentes patógenos, ha sido aplicada al
genotipado del VPH. El análisis de los productos amplificados por PCR se lleva
a cabo mediante la digestión de los mismos con diferentes enzimas de restricción,
originando patrones específicos para cada uno de los tipos del VPH. El
protocolo descrito por Bernard HU y cols. en 199411 ha sido el más utilizado,
y está basado en la digestión del fragmento amplificado (450 pb.) por el sistema
de cebadores MY09/11 con siete enzimas de restricción: Bam HI, Dde I,
Hae III, Hinf I, Pst I, Rsa I y Sau3AI.
Presenta la ventaja con respecto a la secuenciación de poder identificar la
presencia de infecciones múltiples, si bien en muchos casos no es posible
identificar los tipos concretos implicados en la mezcla, fundamentalmente
cuando hay más de dos tipos en la misma. Esta metodología presenta algunas
desventajas importantes:
• Difícil interpretación.
• Diferente sensibilidad en la detección de tipos minoritarios dependiente
de la eficacia del sistema de PCR utilizado.
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