Studio dell'aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces ...

L’allestimento dei campioni è stato effettuato presso il Centro di
Microscopia Elettronica dell’Università degli Studi di Sassari come di
seguito riportato.
Preparazione del campione: le cellule del biofilm, sviluppatosi per una
settimana su vino diluito al 50% con acqua deionizzata sterile, sono state
prelevate con un vetrino coprioggetto e sottoposte a una serie di passaggi
preparativi: fissazione, disidratazione e metallizzazione.
Fissazione: Il primo passaggio ha previsto una fissazione primaria
aldeidica (glutaraldeide al 2,5% in tampone cacolinato per 3 ore, pH 7.2 e
0,2M). Successivamente sono stati eseguiti 3 lavaggi di 5-10 minuti
ciascuno in tampone (lo stesso in cui si diluisce il fissativo) e una post-
fissazione in tetrossido di osmio (OsO4 1% in tampone cacodilato) per
circa un’ora.
Lavaggi: i campioni sono stati lavati per 3 volte in tampone per 5-10 minuti
e poi 3 volte in acqua distillata.
Disidratazione: L’etanolo è stato preparato in concentrazioni crescenti, al
fine di effettuare una disidratazione graduale del campione (al 20% per
10’, al 50% per 10’, al 70% per 10’, all’80% per 10’, al 95% per 15’ e al
100% 3 volte per 20’ ciascuna).
Il successivo allontanamento dei solventi è stato effettuato mediante un
apparecchio, il “critical point dryer” (CPD), nel quale è possibile eliminare il
solvente passando dalla fase liquida a quella gassosa senza attraversare
la fase critica di vapore.
Montaggio del campione: Il campione sottoposto ai trattamenti
sopradescritti è stato montato per l’osservazione su uno stub di alluminio
(supporto portacampioni), per consentire la formazione di un’immagine
interpretabile.
Metallizzazione: La ricopertura del campione è avvenuta mediante
bombardamento con particelle di gas inerte ionizzato con lo scopo di
erodere superficialmente una placca di materiale idoneo (oro-palladio).
Osservazione: L’osservazione dei campioni è stata fatta con l’apparecchio
Zeiss DSM (Digital Scanning Microscopy) 962.
Pinna Claudia
Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae
Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari
Università degli Studi di Sassari
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