Studio dell'aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces ...

More documents

Recommendations

Info

giorni, sono state fotografate al 7° e al 14° giorno. Per ogni ceppo sono state fatte tre repliche. Real Time-PCR Estrazione RNA e retrotrascrizione Le cellule sono state precoltivate in doppio su YPD e incubate overnight a 25 °C in agitazione (200 rpm); sono state successivamente raccolte per centrifugazione a 3000 g x 5 minuti e, dopo aver eliminato il surnatante, sono state lavate con acqua sterile per allontanare i residui di terreno. Una parte è stata trasferita su MF e dopo 24 ore sono state raccolte per centrifugazione. Il pellet è stato quindi conservato a –80 °C per facilitare la lisi cellulare. L’estrazione di RNA è stata fatta con il Kit RNAqueous®- 4PCR (Ambion). Per garantire la completa rimozione di eventuali tracce di DNA i campioni sono stati trattati con 4U/µl di DNAasi per 7 minuti a 30 °C. Gli RNA sono stati conservati a –80 °C. Per la sintesi del cDNA è stato impiegato il kit Superscript TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, Milano). Reazione di qPCR Per la reazione di PCR Real-Time sono stati utilizzati 50 ng del cDNA come templato. Le reazioni di PCR sono state effettuate utilizzando il termociclatore “i Cycler iQ Real-Time PCR detection system instrument” (Biorad, Milano). Mix di ligazione: 2mM MgCl2; 0,2 mM dNTPs; 1 µl SYBR Green (1:20000); 0,2 µM Primer Up; 0,2 µM Primer Lo; 0,5 U Platinum® Taq DNA polymerase (Invitrogen, Milano). Primer utilizzati: FLO11Rtup (5'-AGGTTCAAATGGTGCCAAGA-3') e FLO11Rtlo (5'- AGCCACGCTAGAAGCAGAAG-3') per l’amplificazione di FLO11 e ACT1 up (5’-CGTTCCAATTTACGCTGGTT-3’) e ACT1 lo (5’- TCAGCAGTGGTGGAGAAAGA-3’) per l’amplificazione di ACT1. Il volume totale del mix di ligazione era di 25 µl. Il protocollo termico ha previsto un primo ciclo a 95 °C per 5 minuti per consentire l’attivazione della Taq Pinna Claudia Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari Università degli Studi di Sassari 52
polimerasi Hot-Start utilizzata. Successivamente sono stati eseguiti 45 cicli a 95 °C per 20 sec, 60 °C per 30 sec e 72 °C per 30 sec. La fluorescenza è stata misurata durante la fase di estensione. Al termine della reazione di PCR è stata effettuata la curva di melting che consente di evidenziare una eventuale contaminazione dei campioni. Per poter confrontare il livello di espressione tra ceppi diversi, è stato utilizzato come riferimento il valore dell’espressione del gene housekeeping ACT1. Per la normalizzazione dei risultati ottenuti è stata utilizzata la formula: 2 -∆∆CT dove ∆∆CT= (media del ciclo soglia del gene target-media del ciclo soglia di ACT1) Amplificazione e sequenziamento del promotore di FLO11 Cinquanta ng di DNA genomico sono stati utilizzati come templato nella reazione di PCR per l’amplificazione della regione del promotore del gene FLO11. A tale scopo sono stati progettati due primer omologhi alle sequenze a monte (Up prom flo82 5’ CCAACTAAATCTGAATAACAA 3’) e a valle (Lo prom flo3022 5’ AAGCGAAAGGACCAAATAAGC 3’) del promotore (fig.14). 2800 bp ATG Figura 14 . Schema della PCR per l’amplificazione del promotore di FLO11. In un volume totale di 25 µl di reazione sono stati impiegati: buffer 1x, 100 nM dei due primer, 200 µM per ogni dNTP, 1U di Taq DNA polimerasi Pinna Claudia Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari Università degli Studi di Sassari 53
Page 1 and 2: UNIONE EUROPEA Fondo Sociale Europe
Page 3 and 4: influenzata dalla presenza di ossig
Page 5 and 6: La Biodiversità dei ceppi flor La
Page 7 and 8: utilizzata per caratterizzare la mi
Page 9 and 10: Il vino nuovo viene conservato in b
Page 11 and 12: utilizzati per la caratterizzazione
Page 13 and 14: (flocculine) di parete; FLO1, FLO5,
Page 15 and 16: I meccanismi di adesione cellulare
Page 17 and 18: Il fenomeno di adesione è controll
Page 19 and 20: Entrambe le sequenze contengono una
Page 21 and 22: Figura 6C. La principale patway di
Page 23 and 24: appare poco chiaro. Ad esempio, l
Page 25 and 26: Figura 7. Gli eventi di ricombinazi
Page 27 and 28: tali superfici. La proteina Eap1 è
Page 29 and 30: Reynolds and Fink (2001) hanno effe
Page 31 and 32: Le proprietà di superficie delle c
Page 33 and 34: La presenza di filamenti intercellu
Page 35 and 36: aventi gruppi GPI-ancora, separati
Page 37 and 38: I lieviti flor, appartenenti alla s
Page 39 and 40: principale attivatore trascrizional
Page 41 and 42: eliminato il surnatante; il pellet
Page 43 and 44: Volume finale 20 µl 20 µl 20 µl
Page 45 and 46: Il potere fermentativo è stato det
Page 47 and 48: TTATAAGAATAACATAGCAACACCAGCCAAACC-3
Page 49 and 50: Test fenotipici per valutare le cap
Page 51: pm per 5 minuti e le cellule sono s
Page 55 and 56: Il sequenziamento del promotore del
Page 57 and 58: Per stabilire le concentrazioni da
Page 59 and 60: successivamente con 2 ml di sorbito
Page 61 and 62: Identificazione L’identificazione
Page 63 and 64: Caratterizzazione tecnologica Forma
Page 65 and 66: % CEPPI % CEPPI Il test di sporific
Page 67 and 68: % CEPPI 80 60 40 20 0 12-14% 14-16%
Page 69 and 70: elevato potere fermentativo, un ele
Page 71 and 72: 1250 bp sono stati ritrovati solo i
Page 73 and 74: Tabella 10 . Caratterizzazione mole
Page 75 and 76: ceppi analizzati ve ne sono cinque
Page 77 and 78: % cellule 100 80 60 40 20 posseggon
Page 79 and 80: A28 M12 V99 A51 V75 Figura 36A. Dif
Page 81 and 82: cellule. I risultati ottenuti con l
Page 83 and 84: M12 M23 V23 M46 M66 A9 A43 A51 M39
Page 85 and 86: V80 6,1 3,1 69,66 0,63 5 0,1812 Tab
Page 87 and 88: et al., 2006), dimostra che la dele
Page 89 and 90: Figura 43. Analisi di idrofobicità
Page 91 and 92: peso biofilm (mg) Come si può nota
Page 93 and 94: Identificazione La selezione di cep
Page 95 and 96: oggetto di indagine e nei tre ceppi
Page 97 and 98: è direttamente correlata con la ca
Page 99 and 100: lattosio, maltosio, melibiosio, raf
Page 101 and 102: ceppi analizzati va rivolta verso q
Page 103 and 104:
cerevisiae, le quali interagiscono
Page 105 and 106:
cariotipici determinati in un prece
Page 107 and 108:
confermato questa ipotesi mostrando
Page 109 and 110:
Idrofobicità Le adesine rappresent
Page 111 and 112:
(Natarajan et al., 2001; Kleinschmi
Page 113 and 114:
cresciuti su terreno ricco (tipo YE
Page 115 and 116:
dipendente da una precisa programma
Page 117 and 118:
fattori quali l’elevata concentra
Page 119 and 120:
stato condotto allo scopo di determ
Page 121 and 122:
esponsabile della formazione di bio
Page 123 and 124:
complesse. Infatti, come osservato
Page 125 and 126:
interne di Flo1 corrispondono delle
Page 127 and 128:
Baillie, G. S. & Douglas, L. J. Rol
Page 129 and 130:
Cappellaro, C., Hauser, K., Mrsa, V
Page 131 and 132:
Delneri D., Colson I., Grammenoudi
Page 133 and 134:
l’invecchiamento controllati dell
Page 135 and 136:
Guillamon, J.M., Sabate, J., Barrio
Page 137 and 138:
Kim, T.S., Kim, H.Y., Yoon, J.H., a
Page 139 and 140:
Lo, W.S., and Dranginis, A.M. (1998
Page 141 and 142:
Natarajan, K., Meyer, M.R., Jackson
Page 143 and 144:
Puig S., Perez-Ortin J.E. (2000). E
Page 145 and 146:
Sean P. Palecek, Archita S. Parikh
Page 147 and 148:
expression of FLO1 in Saccharomyces
Page 149:
Zara S, Farris GA, Budroni M, Bakal
show all

Studio dell'aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?