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Formazione del mat cellulare: Nel terreno soft agar il galattosio ha sostituito il glucosio. Test di crescita invasiva: Il YPD è stato sostituito da SC-URA + 2% di galattosio. Pinna Claudia Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari Università degli Studi di Sassari 60
Identificazione L’identificazione molecolare tramite PCR-RFLP della regione ITS dell’rDNA ha prodotto per la maggior parte dei lieviti flor (95%) un prodotto di PCR di 850 bp (Fernandez-Espinar et al., 2000), e solo per tre ceppi isolati da Vernaccia, la taglia della regione ITS è risultata di 880 bp. Tale esito è in accordo con quanto riportato in letteratura per il genere Saccharomyces (Esteve Zarzoso et al., 1999; Fernandez-Espinar et al., 2000; Esteve Zarzoso et al., 2004). Tuttavia, poiché i prodotti di PCR ottenuti da generi e specie diverse possono risultare uguali o simili, per la corretta identificazione della specie è necessario ottenere un profilo di restrizione utilizzando le endonucleasi HaeIII, HinfI e CfoI. I pattern ottenuti sono riportati in tabella 8. Le taglie degli amplificati e dei prodotti di restrizione ottenuti, sono state determinate rispetto al marcatore di peso molecolare (DNA Ladder 1KB, Sigma 10 - 0,5 kb), con il software di acquisizione di immagini Chemi Doc XRS Imaging System (BioRad Laboratories Inc., California). I frammenti di restrizione ottenuti con l’enzima HaeIII hanno permesso di distinguere due diversi profili a quattro bande: il tipico profilo flor è presente nel 95% dei ceppi (Fernandez-Espinar et al., 2000); al contrario i ceppi V72, V80 e V99 esibiscono un pattern identico a quello del ceppo tipo CBS1171 (Esteve Zarzoso et al., 1999). Tabella 8 . Dimensione (bp) della regione ITS amplificata per PCR e dei frammenti di restrizione nei ceppi tipo di S. cerevisiae CBS1171 T CBS380 T e CBS395 T e nei ceppi flor CBS1171 T Ceppi Prodotto PCR (bp) Frammenti di restrizione (bp) HaeIII HinfI CfoI 880 325- 250-175-130 385-375-120 375-355-150 S.cerevisiae CBS380 T S. bayanus 880 500-250-130 385-375-120 375-355-150 CBS395 T S. bayanus. 880 500-250-130 Ceppi flor in studio 850 880 325- 230-170-125 325-250-175-130 385-375-120 375-355-150 375-365-110 385-375-120 345-345-160 375-355-150 Pinna Claudia Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari Università degli Studi di Sassari 61
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Lo, W.S., and Dranginis, A.M. (1998
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Puig S., Perez-Ortin J.E. (2000). E
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Sean P. Palecek, Archita S. Parikh
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