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Reazione di ligazione Per ricavare il rapporto molare tra vettore e inserto da clonare è stata utilizzata la seguente formula: numero di moli= grammi/peso molecolare È pratica comune considerare statisticamente uguale il peso molecolare di ogni singolo paio di basi il cui peso medio è di 660 Dalton. Pertanto risulta che: numero di moli= grammi/660 x n° bp Sviluppando la proporzione e mantenendo il rapporto molare fra vettore e DNA a 1:3 si ottiene: dove: ngvettore= peso espresso in ng del plasmide, Kb vettore= lunghezza in Kb del plasmide; X nginserto= incognita Kb inserto= lunghezza in Kb dell’inserto di DNA da cui deriva che: ngvettore X nginserto : Kb vettore .660 Kb inserto .660 ngvettore . Kb inserto X nginserto . 3 Kb vettore Pinna Claudia Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari Università degli Studi di Sassari 1:3 56
Per stabilire le concentrazioni da utilizzare nelle tre reazioni di ligazione, si è tenuto conto delle diverse dimensioni degli inserti da clonare (FLO11- M23 3,2 Kb; FLO11-V23 3,5 Kb; FLO11-A9 4,7 Kb); in base ai calcoli, le quantità di prodotto di PCR da impiegare sono risultate: 16 ng per l’inserto di 3,2 Kb, 18 ng per quello di 3,5 Kb e 24 ng per il più grande di 4,7 Kb. Poiché è possibile che la resa della ligazione sia inferiore rispetto a quanto calcolato, si è deciso di triplicare queste concentrazioni. Il mix di ligazione è stato effettuato in accordo con il manuale delle istruzioni di pYES TOPO TA Expression Kit (Invitrogen, Milano). Sono stati aggiunti 4 µl di prodotto di PCR, 1 µl di soluzione salina diluita (1,2M NaCl, 0,06M MgCl2) e 1 µl di vettore. Il tempo di incubazione, rispetto a quanto indicato nelle istruzioni del manuale, è stato portato a 60 minuti per i due inserti più piccoli e a 90 minuti per quello di 4,7 Kb. Le reazioni di ligazione sono avvenute alla temperatura di 22 °C. Trasformazione per elettroporazione di Escherichia coli Tre µl della miscela di ligazione sono stati aggiunti a 50 µl di cellule elettrocompetenti di E. coli, fornite col kit. La sospensione cellulare è stata mixata e trasferita in una cuvetta da 0,1 cm (Biorad, Milano) precedentemente tenuta in ghiaccio. I parametri settati per l’elettroporazione sono: capacitanza 25 µF, resistenza 200 Ω e voltaggio 2,5 KV. L’apparecchio utilizzato è il Gene Pulser II System” (Biorad, Milano). Dopo lo shock elettrico, alle cellule sono stati aggiunti 250 µl di terreno SOC previamente mantenuto a 37 °C; la coltura è stata trasferita in tubi Falcon da 15 ml e tenuta in agitazione a 37 °C per 1 ora a 200 rpm. Aliquote di 70 µl sono state poi inoculate per spandimento in piastre di terreno LB+ampicillina e messe in incubatore a 37 °C overnight. Isolamento del plasmide da E. coli (Zhou, 1990) Per ogni trasformazione dieci colonie sono state inoculate in 2 ml di LB + ampicillina (200 mg/l) incubate a 37 °C overnight. Le colture sono state Pinna Claudia Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari Università degli Studi di Sassari 57
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Lo, W.S., and Dranginis, A.M. (1998
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Natarajan, K., Meyer, M.R., Jackson
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Puig S., Perez-Ortin J.E. (2000). E
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Sean P. Palecek, Archita S. Parikh
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expression of FLO1 in Saccharomyces
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Zara S, Farris GA, Budroni M, Bakal
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