Studio dell'aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces ...

successivamente con 2 ml di sorbitolo 1M a 4 °C. Il pellet è stato
risospeso in 1 ml di DTT 25 mM (ditiotreitolo) e tenuto a temperatura
ambiente per 10 minuti. Le cellule sono state centrifugate per eliminare il
DTT, lavate con 2 ml di sorbitolo 1M e risospese in 250 µl di sorbitolo 1M.
Cinquanta µl di sospensione cellulare sono stati mixati con 5 µl di DNA e
trasferiti in cuvetta (0,2 cm Biorad, Milano) per l’elettroporazione
(parametri: 1,5kV, 200Ω, 25 µFaradays, pulse time Ǻ5 millisec) con il
“Gene Pulser II System” (Biorad, Milano). Le cellule sono state diluite con
200 µl di sorbitolo 1M per incrementare il volume e immediatamente
seminate per spandimento su terreno selettivo costituito da SC-URA in
diverse aliquote per ogni piastra. I trasformanti sono stati strisciati su
nuove piastre di terreno SC-URA. Le precolture per l’estrazione di DNA
plasmidico, sono state preparate su 10 ml di terreno SC–URA liquido
secondo il protocollo già riportato. La presenza del plasmide con l’inserto
clonato è stata confermata per PCR impiegando i primer GAL1 Forward:
5’-AATATACCTCTATACTTTAACGTC- 3’ e V5 C-term Reverse: 5’ –
ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3’ secondo il protocollo descritto nel
paragrafo precedente.
Test fenotipici sui trasformanti BY
La presenza del plasmide con il promotore GAL1 all’interno dei ceppi BY + ,
ha reso necessaria l’aggiunta di galattosio nei terreni di test per consentire
l’espressione del gene FLO11. Vengono di seguito riportate le variazioni
apportate ai protocolli per testare i trasformanti.
Per ogni prova le precolture sono state fatte su SC-URA al 2% di
galattosio a 30 °C in agitazione.
Idrofobicità con ottano e adesione su superfici di polistirene: Le cellule
sono state portate in fase esponenziale su SC allo 0,1% e allo 0,5% di
galattosio.
Quantificazione del biofilm: Al terreno di florizzazione SC-URA + etanolo al
4% è stato aggiunto il 2% di galattosio.
Pinna Claudia
Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae
Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari
Università degli Studi di Sassari
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