Studio dell'aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces ...

Adesione su superfici di polistirene (Reynolds & Fink, 2001)
La formazione di biofilm su superfici di polistirene è stata testata su piastre
microtiter da 96 pozzetti, utilizzando il cristal violetto come colorante. La
lettura dell’assorbanza del cristal violetto è proporzionale alla
concentrazione delle cellule che aderiscono alla superficie della piastra.
Anche in questo caso sono state fatte due prove in parallelo: una su
terreno di florizzazione e una su SC (per ogni ceppo e per ogni terreno
sono state previste cinque ripetizioni). Le precolture sono state preparate
inoculando i ceppi in su SC liquido al 2% di glucosio e incubandoli
overnight a 30 °C, in agitatore termostatato (200 rpm). Al termine
dell’incubazione le precolture state centrifugate a 3000 rpm per 5 minuti e
le cellule sono state lavate con acqua sterile. Il pellet è stato risospeso in
terreno di florizzazione e SC allo 0,1% di glucosio fino ad ottenere una
sospensione cellulare con OD600 pari a 1. Cento µl di ciascuna
sospensione cellulare sono stati aliquotati nei microtiter in quintuplo e
incubati in statico per 48 ore a 25 °C in terreno di florizzazione e a 25° C
per 3 ore su SC allo 0,1%. Trascorso il tempo di incubazione sono stati
aggiunti 100 µl di una soluzione di cristal violetto all’ 1% (p/v). Dopo 20
minuti i pozzetti sono stati lavati ripetutamente con acqua distillata,
tamponati con carta assorbente e quindi fotografati; sono stati quindi
aggiunti 100 µl etanolo in ogni pozzetto per consentire il rilascio del
colorante. Trascorsi 25 minuti a 25 °C, i campioni sono stati trasferiti in
una nuova piastra microtiter e sono state fatte le letture allo
spettrofotometro (Spectra MAX M2 d, Molecular Devices) alla lunghezza
d’onda di 570 nm.
Quantificazione del biofilm
Lo sviluppo del biofilm è stato indotto sia su terreno di florizzazione (MF),
sia su un substrato costituito da vino diluito al 50% con acqua sterile
deionizzata e concentrazione alcolica del 5,5%. I ceppi sono stati coltivati
overnight, in agitazione a 30°C, in tubi di polipropilene da 50 ml contenenti
30 ml di YPD liquido. Le colture ottenute sono state centrifugate a 3000
Pinna Claudia
Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae
Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari
Università degli Studi di Sassari
50