Studio dell'aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces ...

polimerasi Hot-Start utilizzata. Successivamente sono stati eseguiti 45 cicli
a 95 °C per 20 sec, 60 °C per 30 sec e 72 °C per 30 sec. La fluorescenza
è stata misurata durante la fase di estensione. Al termine della reazione di
PCR è stata effettuata la curva di melting che consente di evidenziare una
eventuale contaminazione dei campioni. Per poter confrontare il livello di
espressione tra ceppi diversi, è stato utilizzato come riferimento il valore
dell’espressione del gene housekeeping ACT1.
Per la normalizzazione dei risultati ottenuti è stata utilizzata la formula:
2 -∆∆CT
dove
∆∆CT= (media del ciclo soglia del gene target-media del ciclo soglia di ACT1)
Amplificazione e sequenziamento del promotore di FLO11
Cinquanta ng di DNA genomico sono stati utilizzati come templato nella
reazione di PCR per l’amplificazione della regione del promotore del gene
FLO11. A tale scopo sono stati progettati due primer omologhi alle
sequenze a monte (Up prom flo82 5’ CCAACTAAATCTGAATAACAA 3’) e
a valle (Lo prom flo3022 5’ AAGCGAAAGGACCAAATAAGC 3’) del
promotore (fig.14).
2800 bp
ATG
Figura 14 . Schema della PCR per l’amplificazione del promotore di FLO11.
In un volume totale di 25 µl di reazione sono stati impiegati: buffer 1x, 100
nM dei due primer, 200 µM per ogni dNTP, 1U di Taq DNA polimerasi
Pinna Claudia
Studio dell’aggregazione cellulare in ceppi vinari di Saccharomyces cerevisiae
Tesi di Dottorato in Biotecnologie Microbiche Agroalimentari
Università degli Studi di Sassari
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