(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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에 영향을 주지 않으면서 이용될 수 있다. 인간 중쇄 골격 4 서열은 상기 단계 7로부터 CDR3 서열 바로 다음에,
가변 중쇄 인간화된 서열의 끝에 추가된다. 이는 가변 중쇄 인간화된 아미노산 서열의 끝이다
실례: 도 2에서, RbtVH 토끼 중쇄 서열의 골격 4(FR4)는 상동성 인간 중쇄 FR4 서열 위에 도시된다. 인간 FR4
서열은 상기 단계 7에서 추가된 CD3 영역의 끝 바로 다음에, 인간화된 가변 중쇄 서열(VHh)에 추가된다.
항체 및 이들의 단편을 생산하는 방법
본 발명은 또한, 본 명세서에서 기술된 항체 또는 이들의 단편의 생산에 관계한다. 본 명세서에서 기술된 항체
또는 이들의 단편에 상응하는 재조합 폴리펩티드는 교배 적격성 효모의 배수체, 바람직하게는 2배체 또는 4배체
균주로부터 분비된다. 예시적인 구체예에서, 본 발명은 배수체 효모를 포함하는 배양액을 이용하여 연장된
기간, 다시 말하면, 적어도 수일 내지 1주일, 더욱 바람직하게는 적어도 1개월 또는 수개월, 그리고 이보다 더
욱 바람직하게는 적어도 6개월 내지 1년 이상 동안, 분비된 형태로 이들 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법에
관계한다. 이들 배수체 효모 배양액은 적어도 10-25 ㎎/ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 50-250 ㎎/ℓ, 이보다 더
욱 바람직하게는 적어도 500-1000 ㎎/ℓ, 그리고 가장 바람직하게는 1 gram/ℓ 이상의 재조합 폴리펩티드(들)를
발현할 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 한 쌍의 유전적으로 명료한 효모 반수체 세포가 원하는 이형멀티머 단백질의 아단위
를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된다. 한쪽 반수체 세포는 첫 번째 발현 벡터를 포함하고, 그리고 두 번째 반
수체 세포는 두 번째 발현 벡터를 포함한다. 다른 구체예에서, 2배체 효모 세포는 하나 이상의 재조합 폴리펩티
드의 발현과 분비를 제공하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질전환될 것이다. 또 다른 구체예에서, 단일 반수체
세포는 하나 이상의 벡터로 형질전환되고 융합 또는 교배 전략으로 배수체 효모를 생산하는데 이용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이배체 효모 배양액은 원하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 발현과 분비를 제공하는 하나
이상의 벡터로 형질전환될 수 있다. 이들 벡터는 상동성 재조합을 통해, 또는 리콤비나아제(recombinase), 예를
들면, Cre/Lox 또는 Flp/Frt를 이용하여 효모 세포의 게놈 내로 무작위로 통합되는 벡터, 예를 들면, 선형화된
플라스미드 또는 다른 선형 DNA 산물을 포함할 수 있다. 선택적으로, 추가의 발현 벡터가 반수체 또는 2배체 세
포 내로 도입될 수 있다; 또는 첫 번째 또는 두 번째 발현 벡터가 이형삼합체(heterotrimer), 이형사합체
(heterotetramer) 등의 합성을 위한 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 비-동일성 폴리펩티드의 발현 수준은
개별적으로 측정되고, 그리고 적절한 선별, 벡터 사본수, 프로모터 강도 및/또는 유도 등을 통해 조정될 수 있
다. 형질전환된 반수체 세포는 유전적으로 교배되거나 융합된다. 결과의 2배체 또는 4배체 균주는 완전하게 조
립되고 생물학적 기능성인 단백질, 본 명세서에서 기술된 인간화된 항체, 또는 이들의 단편을 생산하고 분비하
는데 이용된다.
단백질 생산을 위한 2배체 또는 4배체 세포의 이용은 예상치 못한 이점을 제공한다. 이들 세포는 반수체 세포
의 성장에 유해할 수 있는 조건에서, 그리고 연장된 기간 동안 생산 목적으로 증대, 다시 말하면, 확대될 수 있
고, 이들 조건은 높은 세포 밀도; 최소 배지에서 성장; 낮은 온도에서 성장; 선택성 압력의 부재에서 안정적인
성장을 포함하고, 그리고 시간의 흐름에서 이종성 유전자 서열 일체성의 유지 및 높은 수준 발현의 유지를 제공
할 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 본 발명자들은 이들 이점이 적어도 부분적으로, 2가지 별개의 모 반수체 균주
로부터 2배체 균주의 산출로부터 발생한다고 이론화한다. 이들 반수체 균주는 다수의 사소한 자가영양 돌연변이
를 포함할 수 있고, 이들 돌연변이는 2배체 또는 4배체에서 보완되고, 높은 선택성 조건 하에 성장 및 강화된
생산을 가능하게 한다.
형질전환된 교배 적격성 반수체 효모 세포는 원하는 단백질의 아단위 편성(subunit pairing)을 가능하게 하는
유전학적 방법을 제공한다. 반수체 효모 균주는 2가지 발현 벡터: 한쪽 폴리펩티드 사슬의 합성을 주동하는 첫
번째 벡터 및 두 번째, 비-동일성 폴리펩티드 사슬의 합성을 주동하는 두 번째 벡터 각각으로 형질전환된다. 이
들 2개의 반수체 균주는 최적화된 표적 단백질 생산이 달성될 수 있는 2배체 숙주를 제공하기 위하여 교배된다.
선택적으로, 추가의 비-동일성 코딩 서열(들)이 제시된다. 이런 서열은 추가의 발현 벡터 상에, 또는 첫 번째
또는 두 번째 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 복합 코딩 서열은 개별 프로모터로
부터 독립적으로 발현되거나, 또는 시스트론(단백질 인코딩 부위)의 개시 코돈, 예를 들면, ATG에 직접적인 내
부 리보솜 결합을 촉진하고, 따라서 유전자의 캡(cap)-독립성 번역을 유발하는 요소인 "내부 리보솜 결합 부위"
또는 "IRES"의 포함을 통해 통합적으로 발현될 수 있다. 효모에서 기능하는 IRES 요소는 Thompson et al.
(2001) P.N.A.S. 98:12866-12868에서 기술된다.
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공개특허 10-2011-0091780