(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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서 최초 특징을 확증하기 위한 기능적 특성이 확인된다. 적절한 경우에, 대규모 일시적 포유동물 형질감염이 완
결되고, 그리고 항체가 단백질 A 친화성 색층분석을 통해 정제된다. Kd는 표준 방법(가령, Biacore) 및 효능
분석에서 IC50을 이용하여 평가된다.
실시예 7 인간 IL-6에 결합하는 항체의 준비
본 명세서에서 기술된 항체 선별 프로토콜을 이용함으로써, 항체의 광범위한 패널을 산출할 수 있다. 상기 항체
는 IL-6에 대하여 높은 친화성(한 자리 내지 두 자리 pM Kd)을 갖고 복수 세포-기초된 스크리닝 시스템(T1165와
HepG2)에서 IL-6의 강력한 길항을 나타낸다. 게다가, 이러한 항체 수집물은 IL-6-주동된 과정에 대하여 상이한
길항 양식을 보인다.
면역화 전략
토끼는 huIL-6(R&R)으로 면역화되었다. 면역화는 완전 Freund 어쥬번트(CFA)(Sigma)에서 100 ㎍의 일차 피하
(sc) 주사, 그 이후에 불완전 Freund 어쥬번트(IFA)(Sigma)에서 각각 50 ㎍의 2주 간격 2회 부스트(boost)로
구성되었다. 동물은 55일 자에 채혈되고, 그리고 혈청 역가가 T1165 세포주를 이용하여 ELISA(항원 인식) 및 비
-방사성 증식 분석(Promega)에 의해 결정되었다.
항체 선별 역가 평가
항원 인식은 4℃에서 하룻밤동안 인산염 완충된 염수(PBS, Hyclone)에서 Immulon 4 평판(Thermo)을 1 ㎍/㎖의
huIL-6(50 ㎕/웰)으로 코팅함으로써 결정되었다. 분석 당일에, 평판은 PBS /Tween 20(PBST tablets,
Calbiochem)로 3회 세척되었다. 평판은 이후, 37℃에서 30분 동안 PBS에서 200 ㎕/웰의 0.5% 비늘 젤라틴(FSG,
Sigma)으로 차단되었다. 차단 용액은 제거되고, 그리고 평판은 블롯팅(blotting)되었다. 혈청 시료는 1:100의
출발 희석도(채혈 및 채혈전)(모든 희석액은 FSG 50 ㎕/웰에서 만들어졌다)에서, 그 이후에 평판을 교차하여
1:10 희석도에서 만들어졌다(칼럼 12는 배경 대조를 위하여 공백으로 남겨졌다). 평판은 37℃에서 30분 동안 배
양되었다. 평판은 PBS/Tween 20으로 3회 세척되었다. 1:5000 희석된 염소 항-토끼 FC-HRP(Pierce)는 모든 웰
(50 ㎕/웰)에 첨가되고, 그리고 평판은 7℃에서 30분 동안 배양되었다. 평판은 앞서 기술된 바와 같이 세척되었
다. 평판은 50 ㎕/웰의 TMB-Stable stop(Fitzgerald Industries)이 첨가되고, 그리고 일반적으로 3 내지 5분
동안 현색되었다. 현색 반응은 50 ㎕/웰 0.5 M HCl로 중단되었다. 평판은 450 nm에서 판독되었다. 광학 밀도
(OD) 대(對) 희석도가 Graph Pad Prizm 소프트웨어를 이용하여 플롯팅(plotting)되고, 그리고 역가가 결정되었
다.
기능적 역가 평가
시료의 기능적 활성은 T1165 증식 분석에 의해 결정되었다. T1165 세포는 HEPES, 피루브산나트륨,
중탄산나트륨, L-글루타민, 고농도 글루코오스, 페니실린/스트렙토마이신, 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청
(FBS)(모든 보충물은 Hyclone으로부터), 2-메르캅토에탄올(Sigma), 그리고 10 ng/㎖의 huIL-6(R&D)으로 보충된
변형된 RPMI 배지(Hyclone)에서 일과적으로 유지되었다. 분석 당일에, 세포 생존능은 트립판 블루(Invitrogen)
에 의해 결정되고, 그리고 세포는 20,000개 세포/웰의 고정 밀도로 접종되었다. 접종에 앞서, 세포는 인간-IL-6
이 없는(5분 동안 13000 rpm에서 원심분리하고 상층액을 버림으로써) 앞서 기술된 배지에서 2회 세척되었다. 최
종 세척후, 세포는 50 ㎕/웰에 동등한 부피에서 세척을 위하여 이용된 동일한 배지에서 재현탁되었다. 세포는
실온에서 방치되었다.
공개특허 10-2011-0091780
둥근-바닥, 96-웰 평판(Costar)에서, 혈청 시료는 시작 시점에 1:100, 그 이후에 5개의 복제물(열 B 내지 F: 희
석은 huIL-6이 없는 앞서 기술된 배지에서 달성됨)에서 30 ㎕/웰에서 평판을 교차하여(칼럼 2 내지 10) 1:10 희
석도로 첨가되었다. 칼럼 11은 IL-6 대조에 대한 배지이었다. 최종 EC50(이전에 결정된 농도)의 4x 농도에서 30
㎕/웰의 huIL-6이 모든 웰에 첨가되었다(huIL-6은 앞서 기술된 배지에서 희석되었다). 웰은 항체 결합이 발생하
도록 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 1시간후, 50 ㎕/웰의 항체-항원(Ab-Ag) 복합체가 둥근-바닥 평판에 배치
된 평판 지도 형식(plate map format)에 따라, 편평-바닥, 96-웰 평판(Costar)으로 이전되었다. 열 G에서, 50
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