(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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대하여 평가된다. 나머지 상층액은 본래대로 방치되고, 그리고 평판은 -70℃에서 동결된다. 이들 조건 하에, 배
양 과정은 전형적으로, 항원-특이적 B 세포의 클론 집단을 포함하는 혼합된 세포 집단을 포함하는 웰을 발생시
킨다, 다시 말하면, 단일 웰은 원하는 항원에 특이적인 단일 단일클론 항체만을 포함할 것이다.
실시예 3 원하는 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체에 대한 항체 상층액의 스크리닝
실시예 2에 따라 생산된 클론 항원-특이적 B 세포 집단을 포함하는 웰로부터 유래된 항체-포함 상층액은
초기에, ELISA 방법을 이용하여 항원 인식에 대하여 스크리닝된다. 이는 선택성 항원 고정화(가령, 스트렙타비
딘 코팅된 평판에 의한 비오틴화된 항원 포획), 비-특이적 항원 평판 코팅, 또는 대안으로, 항원 구축 전략(가
령, 선택성 항원 포획, 그 이후에 이형(heteromeric) 단백질-항원 복합체를 산출하기 위한 결합 파트너 부가)을
포함한다. 항원-양성 웰 상층액은 이후, 리간드에 엄격하게 의존하는 기능-변화 분석에서 선택적으로 조사된다.
이와 같은 한 가지 실례는 재조합 수용체 단백질로 항원 리간드의 자연적인 상호작용을 재현하는 시험관내 단백
질-단백질 상호작용 분석이다. 대안으로, 리간드 의존성이고 용이하게 모니터되는 세포-기초된 반응(가령, 증식
반응)이 이용된다. 현저한 항원 인식과 효능을 보이는 상층액은 양성 웰인 것으로 간주된다. 최초 양성 웰로부
터 유래된 세포는 이후, 항체 회수 상(phase)으로 이전된다.
실시예 4 원하는 항원 특이성의 단일, 항체-생산 B 세포의 회수
세포는 단일 항체 서열을 분비하는 항원-특이적 B 세포의 클론 집단(실시예 2 또는 3에 따라 생산됨)을 포함하
는 웰로부터 분리된다. 분리된 세포는 이후, 단일, 항체-분비 세포를 분리하기 위하여 분석된다. Dynal 스트렙
타비딘 비드는 세포 생존능과 적합한 항원-포함 마이크로비드를 준비하기 위하여 완충 매체 하에, 비오틴화된
표적 항원으로 코팅된다. 그 다음, 항원-적하된 비드, 양성 웰로부터 항체-생산 세포, 그리고 플루오레세인 이
소티오시아네이트(FITC)-표지된 항-숙주 H&L IgG 항체(언급된 바와 같이, 숙주는 임의의 포유동물 숙주, 예를
들면, 토끼, 생쥐, 쥐 등일 수 있다)는 37℃에서 함께 배양된다. 생성된 혼합물은 이후, 유리 슬라이드 상에서
분취량(aliquot)으로 재-피펫팅되고, 따라서 각 분취량은 평균적으로, 단일, 항체-생산 B-세포를 보유한다. 항
원-특이적, 항체-분비 세포는 이후, 형광 현미경을 통해 검출된다. 분비된 항체는 결합된 항원으로 인하여 인접
한 비드 상에 국지적으로 집중되고, 그리고 강한 형광 신호에 기초하여 국지화 정보를 제공한다. 항체-분비 세
포는 이들 분비 세포에 인접하게 형성된 항체-항원 복합체의 FITC 검출을 통해 확인된다. 이러한 복합체의 중심
에서 관찰되는 단일 세포는 이후, 미세조작기(micromanipulator)를 이용하여 회수된다. 세포는 항체 서열 회수
가 시작될 때까지 -80℃에서 보관 동안 에펜도르프 PCR 튜브에서 순간-동결된다.
실시예 5 항원-특이적 B 세포로부터 항체 서열의 분리
항체 서열은 실시예 4에 따라 생산된 단일 분리된 B-세포로부터, 또는 실시예 2에 따라 획득된 클론 B 세포 집
단으로부터 분리된 항원 특이적 B 세포로부터 통합 RT-PCR 기초된 방법을 이용하여 회수된다. 표적 면역글로불
린 유전자(중쇄와 경쇄)의 보존 영역과 불변 영역, 예를 들면, 토끼 면역글로불린 서열에 어닐링하는 프라이머
가 설계되고, 그리고 항체 서열을 획득하기 위하여 2-단계 이중(nested) PCR 회수 단계가 이용된다. 각 웰로부
터 앰플리콘은 회수와 크기 일체성에 대하여 분석된다. 결과의 단편은 이후, 서열 클론형성능(sequence
clonality)을 핑거프린팅(fingerprinting)하기 위하여 AluI로 절단된다. 동일한 서열은 그들의 전기영동 분석에
서 공통의 단편화 패턴을 보인다. 유의하게는, 세포 클론형성능을 입증하는 이러한 공통의 단편화 패턴은 일반
적으로, 초기에 1000개 세포/웰까지 도말된 웰에서도 관찰된다. 최초 중쇄와 경쇄 앰플리콘 단편은 이후, 클로
닝을 위한 DNA의 개별 조각을 준비하기 위하여 HindIII과 XhoI, 또는 HindIII과 BsiWI로 제한 효소 절단된다.
결과의 절단물은 이후, 플라스미드 증식과 생산을 위하여 발현 벡터 내로 결찰되고 세균 내로 형질전환된다. 콜
로니는 서열 특성화를 위하여 선별된다.
실시예 6 원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체의 재조합 생산
공개특허 10-2011-0091780
단일 단일클론 항체를 포함하는 각 웰에 대한 정확한 전장 항체 서열이 확립되고, Qiagen 고체-상 방법을 이용
하여 miniprep DNA가 준비된다. 상기 DNA는 이후, 재조합 전장 항체를 생산하기 위하여 포유동물 세포를 형질감
염시키는데 이용된다. 가공되지 않은 항체 산물은 항원 인식에 대하여 조사되고, 그리고 재조합 항체 단백질에
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