(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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본 발명의 한 구체예에서, IgA의 강화된 안정성을 제공하는 항체 서열은 분비 J 사슬과 공동으로
생산된다(참조: U.S. 특허 Nos. 5,959,177; 그리고 5,202,422).
바람직한 구체예에서, 이들 2개의 반수체 효모 균주는 각각 영양요구성이고, 그리고 이들 반수체 세포의 성장을
위하여 배지의 보완을 필요로 한다. 이들 한 쌍의 영양요구체는 상보적이고, 따라서 2배체 산물은 반수체 세포
에 요구되는 보완물질의 부재에서 성장할 것이다. 효모에서 아미노산(가령, met, lys, his, arg 등), 뉴클레오
시드(가령, ura3, ade1 등) 등에 대한 요구를 비롯하여 많은 유전자 마커가 공지되어 있다. 아미노산 마커가 본
발명의 방법에 바람직할 수 있다. 대안으로, 원하는 벡터를 포함하는 2배체 세포는 다른 수단에 의해, 예를 들
면, 다른 마커, 예를 들면, 녹색 형광 단백질, 항생제 내성 유전자, 다양한 우성 선별가능 마커 등의 이용에 의
해 선별될 수 있다.
2개의 형질전환된 반수체 세포는 유전적으로 교배되고, 그리고 이러한 교배 사건으로부터 발생하는 2배체 균주
는 그들의 하이브리드 영양 요구 및/또는 항생제 내성 스펙트럼에 의해 선별될 수 있다. 대안으로, 이들 2개의
형질전환된 반수체 균주의 집단은 스페로플라스트화되고 융합되고, 그리고 2배체 자손이 재생되고 선별된다. 어
느 한쪽 방법에 의해, 2배체 균주는 그들의 모와 상이한 배지에서 성장하는 능력에 기초하여, 확인되고 선별적
으로 성장될 수 있다. 가령, 이들 2배체 세포는 항생제를 포함하는 최소 배지에서 성장될 수 있다. 이러한 2배
체 합성 전략은 일정한 이점을 갖는다. 2배체 균주는 재조합 단백질의 생산 및/또는 분비에 영향을 줄 수 있는,
기초 돌연변이에 더욱 넓은 보완을 통하여 강화된 수준의 이종성 단백질을 생산하는 잠재력을 갖는다. 게다가,
일단 안정적인 균주가 획득되면, 이들 균주를 선별하는데 이용되는 임의의 항생제는 성장 배지 내에 반드시 연
속적으로 존재할 필요가 없다. 앞서 언급된 바와 같이, 일부 구체예에서, 반수체 효모는 단일 또는 복합 벡터로
형질전환되고, 그리고 상기 벡터(들)를 포함하는 2배체 세포를 생산하기 위하여 비-형질전환된 세포와 교배되거
나 융합될 수 있다. 다른 구체예에서, 배수체 효모 세포는 2배체 효모 세포에 의한 원하는 이종성 폴리펩티드의
발현과 분비를 제공하는 하나 이상의 벡터로 형질전환될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 2개의 반수체 균주는 폴리펩티드의 라이브러리, 예를 들면, 항체 중쇄 또는 경쇄의
라이브러리로 형질전환된다. 이들 폴리펩티드를 합성하는 형질전환된 반수체 세포는 상보성 반수체 세포와 교배
된다. 결과의 2배체 세포는 기능성 단백질에 대하여 스크리닝된다. 이들 2배체 세포는 기능 검사를 위한 다수의
폴리펩티드 조합을 신속하고, 편의하고, 저렴하게 확보하는 수단을 제공한다. 이러한 기술은 특히, 최적화된 아
단위 합성 수준이 기능성 단백질 발현과 분비에 결정적인 이형이합체 단백질 산물의 산출에 적용가능하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 2개의 아단위의 발현 수준 비율은 산물 산출을 최대화시키기 위하여 조절된다.
이형이합체 아단위 단백질 수준은 이전에, 최종 산물 산출에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다(Simmons LC, J
Immunol Methods. 2002 May 1;263(1-2):133-47). 조절은 발현 벡터 상에 존재하는 마커에 대한 선별에 의해 교
배 단계에 앞서 달성될 수 있다. 벡터의 사본수를 안정적으로 증가시킴으로써, 발현 수준이 증가될 수 있다. 일
부 사례에서, 폴리펩티드의 아단위 간에 균형된 비율에 도달하기 위하여 다른 사슬에 비하여 한쪽 사슬의 수준
을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 항생제 내성 마커, 예를 들면, Zeocin(플레오마이신) 내성 마커, G418
내성 등이 이런 목적에 유용하고 더욱 높은 수준의 Zeocin(플레오마이신) 또는 G418에 내성인 형질전환체를
선별함으로써 균주 내에서 발현 벡터의 복수 통합된 사본을 포함하는 균주에 대한 농축 수단을 제공한다. 아단
위 유전자의 적절한 비율, 예를 들면, 1:1; 1:2 등은 효과적인 단백질 생산에 중요할 수 있다. 심지어 양쪽 아
단위를 전사하기 위하여 동일한 프로모터가 이용될 때, 많은 다른 인자가 발현된 단백질의 최종 수준에 기여하
고, 이런 이유로 다른 쪽에 비하여 한쪽 인코딩된 유전자의 사본의 숫자를 증가시키는 것이 유용할 수 있다. 대
안으로, 단일 사본 벡터 균주에 비하여 더욱 높은 수준의 폴리펩티드를 생산하는 2배체 균주는 발현 벡터의 복
수 사본을 보유하는 2개의 반수체 균주를 교배함으로써 산출된다.
숙주 세포는 앞서 기술된 발현 벡터로 형질전환되고, 교배되어 2배체 균주를 형성하고, 그리고 프로모터를 유도
하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하기 위하여 적절하게 변형된
전통적인 영양 배지에서 배양된다. 효모의 성장에 적합한 다수의 최소 배지는 당분야에 공지되어 있다. 이들
배지는 필요에 따라, 염(가령, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 그리고 인산염), 완충제(가령, 인산염, HEPES), 뉴
클레오시드(가령, 아데노신과 티미딘), 항생제, 미량 원소, 그리고 글루코오스 또는 등가의 에너지 공급원으로
보충될 수 있다. 임의의 다른 필요 보충물질 역시 당업자에게 공지되어 있는 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배
양 조건, 예를 들면, 온도, pH 등은 발현을 위하여 선별된 숙주 세포에서 기존에 이용된 것들이고, 그리고 당업
자에게 명백할 것이다.
공개특허 10-2011-0091780
분비된 단백질은 배양 배지로부터 회수된다. 프로테아제 저해제, 예를 들면, 페닐 메틸 설포닐 플루오르화물
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