(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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㎕/웰의 배지가 배경 대조를 위하여 모든 웰(칼럼 2 내지 11)에 첨가되었다. 유보된 50 ㎕/웰의 세포 현탁액이
모든 웰(칼럼 2 내지 11, 열 B 내지 G)에 첨가되었다. 칼럼 1과 12, 그리고 열 A와 H에서, 검사 웰의 증발을 예
방하고 가장자리 효과(edge effect)를 최소화시키기 위하여 200 ㎕/웰의 배지가 첨가되었다. 평판은 37℃에서
72시간 동안 4% CO2에서 배양되었다. 72시간 시점에, 20 ㎕/웰의 CellTiter96(Promega) 시약이 제조업체 프로토
콜에 따라 모든 검사 웰에 첨가되고, 그리고 평판은 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 2시간 시점에, 평판은 검
사 웰에서 세포를 분산시키고 균질성을 가능하게 하기 위하여 오비탈 진탕기(orbital shaker)에서 온화하게 혼
합되었다. 평판은 490 nm 파장에서 판독되었다. 광학 밀도(OD) 대(對) 희석도가 Graph Pad Prizm 소프트웨어를
이용하여 플롯팅(plotting)되고, 그리고 기능적 역가가 결정되었다. 양성 분석 대조 평판은 1 ㎍/㎖의 출발 농
도(최종 농도), 그 이후에 평판을 교차하여 1:3 희석도에서 MAB2061(R&D Systems)을 이용하여 앞서 기술된 바와
같이 수행되었다.
조직 수확
일단 허용가능 역가가 확립되면, 토끼(들)는 희생되었다. 비장, 림프절, 그리고 전혈이 수확되고 아래와 같이
처리되었다:
비장과 림프절은 20 cc 주사기의 플런저로 조직을 분리시키고 70 ㎛에서 무균 와이어 메시(wire mesh)(Fisher)
에 밀어 넣음으로써 단일 세포 현탁액으로 처리되었다. 세포는 huIL-6이 없지만 소량의 글루코오스가 존재하는
앞서 기술된 변형된 RPMI 배지에서 수집되었다. 세포는 원심분리에 의해 2회 세척되었다. 최종 세척후, 세포 밀
도는 트립판 블루에 의해 결정되었다. 세포는 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리되었다; 상층액은 폐기되었다.
세포는 FBS(Hyclone)에서 적절한 부피의 10% 디메틸 설폭시드(DMSO, Sigma)에서 재현탁되고 1 ㎖/바이알로 분배
되었다. 바이알은 이후, 장기 보관을 위한 액체 질소(LN2) 탱크에 배치되기에 앞서 -70℃에서 24시간 동안 보관
되었다.
말초혈 단핵 세포(PBMC)는 전혈을 각 분율의 FBS-없는 앞서 기술된 저농도 글루코오스 배지와 혼합함으로써 분
리되었다. 35 ㎖의 전혈 혼합물은 45 ㎖ 원뿔형 튜브(Corning) 내로 8 ㎖의 Lympholyte Rabbit(Cedarlane) 상
에 조심스럽게 층으로 쌓아지고 중단 없이 2500 rpm에서 실온에서 30분 동안 원심분리되었다. 원심분리후, PBMC
층은 유리 Pasteur 피펫(VWR)을 이용하여 조심스럽게 제거되고, 합쳐지고, 그리고 깨끗한 50 ㎖ 바이알 내에 배
치되었다. 세포는 1500 rpm에서 실온에서 10분 동안 원심분리에 의해 앞서 기술된 변형된 배지로 2회 세척되고,
그리고 세포 밀도가 트립판 블루 염색에 의해 결정되었다. 최종 세척후, 세포는 적절한 부피의 10% DMSO/FBS 배
지에서 재현탁되고 앞서 기술된 바와 같이 동결되었다.
B 세포 배양
B 세포 배양을 셋업한 당일에, PBMC, 비장세포, 또는 림프절 바이알은 이용을 위해 해동되었다. 바이알은 LN2
탱크로부터 제거되고 해동될 때까지 37℃ 물 중탕에 배치되었다. 바이알의 내용물은 15 ㎖ 원뿔형 원심분리 튜
브(Corning) 내로 이전되고, 그리고 앞서 기술된 10 ㎖의 변형된 RPMI가 상기 튜브에 천천히 첨가되었다. 세포
는 1.5K rpm에서 5분 동안 원심분리되고, 그리고 상층액이 폐기되었다. 세포는 10 ㎖의 새로운 배지에서 재현탁
되었다. 세포 밀도 및 생존능이 트립판 블루에 의해 결정되었다. 세포는 다시 세척되고 1E07 세포/80 ㎕ 배지에
서 재현탁되었다. 세포 현탁액은 3 ㎍/㎖의 최종 농도에서 비오틴화된 huIL-6(B huIL-6)이 첨가되고 4℃에서 30
분 동안 배양되었다. 결합되지 않은 B huIL-6은 인산염-완충된 (PBF):Ca/Mg 없는 PBS(Hyclone), 2 mM 에틸렌디
아민 테트라아세트산(EDTA), 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma-비오틴 없음)의 10 ㎖ 세척액으로 2회
제거되었다. 두 번째 세척후, 세포는 1E07 세포/80 ㎕ PBF에서 재현탁되었다. 20 ㎕의 MACS
스트렙타비딘 비드(Milteni)/10E7 세포가 세포 현탁액에 첨가되었다. 세포는 4℃에서 15분 동안 배양되었다.
세포는 2 ㎖의 PBF/10E7 세포로 1회 세척되었다. 세척후, 이들 세포는 1E08 세포/500 ㎕의 PBF에서 재현탁되고
유보되었다. MACS
공개특허 10-2011-0091780
MS 칼럼(Milteni)은 자석 스탠드(Milteni) 상에서 500 ㎖의 PBF로 미리 헹굼되었다. 세포 현탁액은 프리-필터
를 통해 칼럼에 적용되고, 그리고 결합되지 않은 분획물이 수집되었다. 상기 칼럼은 1.5 ㎖의 PBF 완충액으로
세척되었다. 상기 칼럼은 자석 스탠드로부터 제거되고 깨끗한 무균 5 ㎖ 폴리프로필렌 Falcon 튜브 상에 배치되
었다. 1 ㎖의 PBF 완충액이 칼럼의 상부에 첨가되고, 그리고 양성 선별된 세포는 수집되었다. 양성과 음성 세포
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