(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

[1273]
[1274]
[1275]
[1276]
[1277]
[1278]
[1279]
[1280]
[1281]
실시예 8 효모 세포 발현
항체 유전자: 키메라 인간화된 토끼 단일클론 항체의 합성을 주동하는 유전자가 클로닝되고 작제되었다.
발현 벡터: 본 벡터는 아래의 기능적 성분을 포함한다: 1) 대장균(Escherichia coli)의 세포 내에서 플라스미드
벡터의 복제를 조장하는 돌연변이 ColE1 복제 기점; 2) 항생제 Zeocin(플레오마이신)에 대한 내성을
공여하고, 그리고 대장균(E. coli)과 피치아 파스토리스(P. pastoris) 둘 모두의 형질전환에 대한 선별가능 마
커로서 기능하는 세균 Sh ble 유전자; 3) 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 알파 교배 인
자 프리 프로 분비 리더 서열을 인코딩하는 서열, 그 다음에 피치아 파스토리스(P. pastoris) 알코올 산화효소
I 유전자(AOX1)로부터 피치아 파스토리스(P. pastoris) 전사 종결 신호를 인코딩하는 서열에 융합된 글리세르알
데히드 탈수소효소(glyceraldehyde dehydrogenase) 유전자(GAP 유전자) 프로모터로 구성되는 발현 카세트.
Zeocin(플레오마이신) 내성 마커 유전자는 더욱 높은 수준의 Zeocin(플레오마이신)에 내성을 갖는 형질전환
체를 선별함으로써, 균주 내에서 발현 벡터의 복수 통합된 사본을 포함하는 균주에 대한 농축의 수단을 제공한
다.
피치아 파스토리스(P. pastoris) 균주: 피치아 파스토리스(P. pastoris) 균주 met1, lys3, ura3과 ade1이 이용
될 수 있다. 임의의 2가지 상보성 세트의 영양요구성 균주가 2배체 균주의 작제와 유지에 이용될 수 있긴 하지
만, 이들 두 균주는 2가지 이유로 본 발명의 방법에 특히 적합하다. 첫째, 이들 균주는 그들의 교배 또는 융합
의 결과물인 2배체 균주보다 더욱 느리게 성장한다. 따라서 적은 숫자의 반수체 ade1 또는 ura3 세포가 배양액
내에 존재하거나, 또는 감수분열 또는 다른 기전을 통하여 발생하면, 2배체 균주는 배양액 내에서 이들보다 빨
리 자란다.
둘째, 교배로부터 발생하는 2배체 Ade+ 콜로니는 정상적인 백색 또는 크림색인 반면, 반수체 ade1 돌연변이체인
임의의 균주의 세포는 독특한 핑크색을 갖는 콜로니를 형성할 것이기 때문에, 이들 균주의 성적 상태를 모니터
하는 것이 용이하다. 이에 더하여, 반수체 ura3 돌연변이체인 임의의 균주는 약물 5-플루오르-오로틴산(FOA)에
내성이고 FOA를 포함하는 최소 배지 + 우라실 평판 상에 배양액의 시료를 도말함으로써 민감하게 확인될 수 있
다. 이들 평판에서, 우라실-요구 ura3 돌연변이(아마도 반수체) 균주만 성장하고 콜로니를 형성할 수 있다. 따
라서 ade1과 ura3으로 표기된 반수체 모 균주로, 결과의 항체-생산 2배체 균주의 성적 상태를 용이하게 모니터
할 수 있다(반수체 대(對) 2배체)
방법
경쇄와 중쇄 항체 유전자의 전사를 위한 pGAPZ-알파 발현 벡터의 작제. 인간화된 경쇄와 중쇄 단편은 PCR 주동
된 과정을 통해 pGAPZ 발현 벡터 내로 클로닝되었다. 회수된 인간화된 구조체는 아래의 프라이머 (1) 경쇄 전방
AGCGCTTATTCCGCTATCCAGATGACCCAGTC(AfeI 부위는 단일 밑줄로 표시됨)를 이용하는 표준 KOD 중합효소(Novagen)
키트 조건((1) 94℃, 2분; (2) 94℃, 30초; (3) 55℃, 30초; (4) 72℃, 30초-35회 동안 단계 2-4 사이클링;
(5) 72℃ 2분) 하에 증폭에 종속되었다. HSA 신호 서열의 끝은 이중 밑줄로 표시되고, 그 다음에 성숙 가변 경
쇄에 대한 서열(밑줄로 표시되지 않음); 역방 CGTACGTTTGATTTCCACCTTG가 위치한다.
가변 경쇄 후방 프라이머. BsiWI 부위가 밑줄로 표시되고, 그 다음에 가변 경쇄의 3' 말단에 대한 역방 보체가
위치한다. AfeI와 BsiWI로 제한 효소 절단 시에, 이는 이출을 위한 인간 카파 경쇄 불변 영역과 인 프레임(in
frame)으로 인간 HAS 리더 서열을 이용하여 pGAPZ 벡터와 인-프레임으로 삽입을 가능하게 한다. (2) 중쇄에 대
하여 유사한 전략이 수행된다. 이용된 전방 프라이머는 AGCGCTTATTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC이다. AfeI 부위는
단일 밑줄로 표시된다. HSA 신호 서열의 끝은 이중 밑줄로 표시되고, 그 다음에 성숙 가변 중쇄에 대한 서열(밑
줄로 표시되지 않음)이 위치한다. 역방 중쇄 프라이머는 CTCGAGACGGTGACGAGGGT이다. XhoI 부위는 밑줄로 표시되
고, 그 다음에 가변 중쇄의 3' 말단에 대한 역방 보체가 존재한다. 이는 비교 지향성 클로닝 전략(comparable
directional cloning strategy)을 이용하여 pGAPZ 내에 앞서 삽입된 IgG-γ1 CH1-CH2-CH3 부위와 인-프레임으
로 중쇄의 클로닝을 가능하게 한다.
공개특허 10-2011-0091780
피치아 파스토리스(P. pastoris)의 반수체 ade1, ura3, met1과 lys3 숙주 균주 내로 발현 벡터의 형질전환. 반
수체 피치아 파스토리스(P. pastoris) 균주의 형질전환 및 피치아 파스토리스(P. pastoris) 유성 주기의 유전자
조작에 이용된 모든 방법은 Higgins, D. R., and Cregg, J. M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in
- 139 -