(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ에서 기술된다.
형질전환에 앞서, 각 발현 벡터는 피치아 파스토리스(P. pastoris) 게놈의 GAP 프로모터 좌위 내로 이들 벡터의
통합을 유도하기 위하여, GAP 프로모터 서열 내에서 AvrII로 선형화된다. 각 벡터의 시료는 이후, 전기천공
(electroporation)에 의해 ade1, ura3, met1과 lys3 균주의 전기적격성 배양액 내로 개별적으로 형질전환되고,
그리고 성공적인 형질전환체는 상기 항생제에 대한 그들의 내성에 의해 YPD Zeocin(플레오마이신) 평판 상에
서 선별되었다. 결과의 콜로니는 선별되고, YPD Zeocin(플레오마이신) 평판 상에서 단일 콜로니에 대하여 스
트리킹(streaking)되고, 이후 적절한 항체 유전자 삽입물에 대한 각 균주로부터 추출된 게놈 DNA 상에서 PCR 분
석에 의해 및/또는 콜로니 리프트/면역블롯 방법으로 항체 사슬을 합성하는 각 균주의 능력에 의해, 항체 유전
자 삽입물의 존재에 대하여 조사되었다(Wung et al. Biotechniques 21 808-812 (1996)). 3가지 중쇄 구조체 중
에서 한 가지를 발현하는 반수체 ade1, met1과 lys3 균주는 반수체 ura3 균주 발현 경쇄 유전자와 함께 2배체
작제를 위하여 수집된다. 이들 반수체 발현 중쇄 유전자는 2배체 분비 단백질을 산출하기 위하여, 적절한 경쇄
반수체 ura3과 교배된다.
단일 항체 사슬을 합성하는 반수체 균주의 교배 및 사합체 기능적 항체를 합성하는 2배체 유도체의 선별. 피치
아 파스토리스(P. pastoris) 반수체 균주를 교배하기 위하여, 교배되는 각각의 ade1(또는 met1 또는 lys3) 중쇄
생산 균주는 풍부한 YPD 평판을 교차하여 스트리킹되고, 그리고 ura3 경쇄 생산 균주는 두 번째 YPD 평판을 교
차하여 스트리킹된다(평판당 ~10개 스트리킹). 30℃에서 1일 또는 2일 배양후, 중쇄 균주를 포함하는 하나의 평
판 및 ura3 경쇄 균주를 포함하는 하나의 평판으로부터 세포는 각각의 중쇄 균주가 각 경쇄 균주와 혼합된 세포
의 패치를 포함하도록 하기 위하여, 교차 해치드 패턴(cross hatched pattern)으로 복제-도말 블록 상에서 무균
벨벳 천으로 이전되었다. 교차-스트리킹된 복제 도말된 세포는 이후, 교배 평판으로 이전되고 균주 간에 교배의
시작을 촉진하기 위하여 25℃에서 배양되었다. 2일후, 이들 교배 평판 상에서 세포는 복제-도말 블록 상에서 무
균 벨벳으로 다시 이전되고, 이후 최소 배지 평판으로 이전되었다. 이들 평판은 독립영양성 2배체 균주의 콜로
니의 선택성 성장을 가능하게 하기 위하여, 3일 동안 30℃에서 배양되었다. 발생된 콜로니는 정선되고, 그리고
콜로니 분리물을 선별하고 각각의 2배체 균주를 정제하기 위하여 두 번째 최소 배지 평판 상에 스트리킹된다.
결과의 2배체 세포주는 이후, 항체 생산에 대하여 조사된다.
추정 2배체 균주는 그들이 2배체이고 항체 생산을 위한 양쪽 발현 벡터를 포함한다는 것을 증명하기 위하여 시
험된다. 2배수성의 경우에, 균주의 시료는 이들 균주가 감수분열을 겪고 포자를 형성하도록 촉진하기 위하여 교
배 평판 상에 발라진다. 반수체 포자 산물은 수집되고 표현형에 대하여 조사된다. 결과의 포자 산물 중에서 유
의한 비율이 단일 또는 이중 영양요구체이면, 최초 균주는 2배체인 것으로 결론될 수 있다. 2배체 균주는 각각
으로부터 게놈 DNA를 추출하고 각 유전자에 특이적인 PCR 반응에 이러한 DNA를 이용함으로써 양쪽 항체 유전자
의 존재에 대하여 조사된다.
단일 항체 사슬을 합성하는 반수체 균주의 융합 및 사합체 기능적 항체를 합성하는 2배체 유도체의 선별. 앞서
기술된 교배 절차에 대한 대안으로, 단일-사슬 항체 생산 반수체 ade1과 ura3 균주의 개별 배양액은 스페로플라
스트화되고, 그들의 결과의 스페로플라스트는 폴리에틸렌 글리콜/CaCl2를 이용하여 융합된다. 융합된 반수체 균
주는 이후, 2배체 균주가 그들의 세포 벽을 재생시키고 가시적인 콜로니로 성장할 수 있도록 하기 위하여, 1 M
소르비톨과 최소 배지를 포함하는 아가에 끼워 넣어진다. 결과의 콜로니는 아가로부터 정선되고, 최소 배지 평
판 상에 스트리킹되고, 그리고 이들 평판은 2배체 세포주의 단일 세포로부터 콜로니를 산출하기 위하여 30℃에
서 2일 동안 배양된다. 결과의 추정 2배체 세포주는 이후, 앞서 기술된 바와 같이 2배수성 및 항체 생산에 대하
여 조사된다.
항체의 정제와 분석. 전장 항체의 생산을 위한 2배체 균주는 앞서 기술된 방법을 이용하여 met1 경쇄와 lys3 중
쇄의 교배를 통하여 도출된다. 2배체 피치아 파스토리스(P. pastoris) 발현 균주의 진탕-플라스크 또는 발효기
배양액으로부터 배양액 배지는 수집되고, 그리고 SDS-PAGE 및 인간 IgG의 중쇄와 경쇄, 또는 특히, IgG의 중쇄
에 대한 항체를 이용한 면역블롯팅(immunoblotting)을 통해 항체 단백질의 존재에 대하여 조사된다.
효모 분비된 항체를 정제하기 위하여, 항체 생산 배양액으로부터 정화된 배지는 단백질 A 칼럼에 통과되고, 그
리고 20 mM 나트륨 인산염, pH 7.0, 결합 완충액으로 세척후, 단백질 A 결합된 단백질이 0.1 M 글리신 HCl 완충
액, pH 3.0을 이용하여 용출된다. 가장 많은 전체 단백질을 포함하는 분획물은 항체 단백질에 대하여 Coomasie
blue 염색된 SDS-PAGE 및 면역블롯팅에 의해 조사된다. 항체는 IL-6 인식을 위한 앞서 기술된 ELISA를 이용하여
특성화된다.
공개특허 10-2011-0091780
항체 활성의 분석. 재조합 효모-유래된 인간화된 항체는 앞서 기술된 IL-6 주동된 T1165 세포 증식 분석 및 IL-
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