Revista Newslab Edição 166

RADAR CIENTÍFICO III
para dispensar os volumes adequados de tampão
TD + ATM, exceto para o controle manual de 25
µL. Realizou-se incubação de tagmentação a 55°C
no termociclador ProFlex da ThermoFisher. Usou-se
uma placa de PCR diferente para cada tamanho
de volume de reação para explicar as diferenças
no aquecimento. Para neutralizar a tagmentação,
dispensou-se tampão de NT usando o Manipulador
de Líquidos Echo 525. Realizou-se amplificação
PCR de bibliotecas tagmentadas a vários volumes.
Primers de Indexação e Nextera PCR Mix (NPM)
foram dispensados em volumes variados pelo
Manipulador de Líquidos Echo 525. Rodouse
amplificação em base de volume de reação
seguindo as condições de PCD do Nextera XT. Em
seguida as bibliotecas foram limpas manualmente
usando limpeza de bead de SPRI a uma proporção
de 0.6x. Cada biblioteca foi então quantificada
por meio de ensaio Picogreen. O Manipulador de
Líquidos Echo 525 foi usado neste ensaio para
dispensar as amostras, bem como os reagentes
Picogreen para uma reação miniaturizada de 20 µL
em placa Greiner de 384 poços e os resultados foram
lidos no BMG PHERAstar. Cada biblioteca também
sofreu análise de tamanho de fragmentos por
TapeStation 2200. O Manipulador de Líquidos Echo
525 foi usado para dispensar amostra e reagente
na placa de ensaio. Usando uma combinação de
dados de quantificação e dados de tamanho médio
de fragmentos, geramos uma lista de trabalho de
normalização. O Manipulador de Líquidos Echo
525 conseguiu então normalizar simultaneamente
e centralizar as bibliotecas transferindo quantias
pequenas e exatas de bibliotecas em um poço.
Essa biblioteca centralizada foi então quantificada
por Qubit, normalizada para 4 nM, desnaturada
por hidróxido de sódio, e depois carregada em
um instrumento Illumina MiSeq para leituras de
300bp de extremidade pareada. Os dados foram
então analisados no software Biomatters Geneious,
em alinhamento com o genoma de referência do
E. coli K-12 MG1655 do NCBI usando o alinhador
Geneious. A tabela abaixo apresenta um resumo
dos resultados.
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Revista NewsLab Edição 166 | Julho 2021