Revista Newslab Edição 166

RADAR CIENTÍFICO III
MiSeq v3, estávamos confortáveis multiplexando
essas amostras e produzindo cobertura com forte
confiança estatística. Queríamos testar a robustez
do fluxo de trabalho miniaturizado com uma
variedade de tamanhos de genoma, conteúdo
GC e organizações de genomas. Além disso, a
amostra de microbioma continha 10 organismos
comumente testados nessa aplicação.
Procuramos determinar se a identificação do
organismo e da cepa era possível nessa escala, e
se as frequências do organismo eram preservadas
durante todo o processo. A amostra de gDNA para
cada organismo foi primeiramente normalizada
manualmente a uma concentração de 5 ng/
μL. Em seguida, o procedimento de preparo
da biblioteca foi realizado como descrito no
experimento acima, agora utilizando volumes
de reação tagmentação /PCR de 2.5 μL/5 μL. As
bibliotecas foram então limpas manualmente
utilizando a limpeza de beads SPRI em uma
proporção de 0,6x, quantificadas por ensaio
Picogreen, e analisadas por TapeStation
2200. Usando uma combinação de dados de
quantificação e dados de tamanho médio de
fragmentos, geramos uma lista de trabalho de
normalização. O Manipulador de Líquidos Echo
525 foi então capaz de normalizar e centralizar
simultaneamente as bibliotecas, transferindo
quantias pequenas e precisas de bibliotecas em
um poço. Essa biblioteca centralizada foi então
quantificada com Qubit, normalizada até 4 nM,
desnaturada por hidróxido de sódio, depois
carregada em instrumento Illumina MiSeq para
leituras de 300pb de extremidade pareada. Cada
amostra foi alinhada com seu respectivo genoma
de referência ou parente próximo de NCBI, e os
dados de sequenciamento foram calculados
usando-se o software da Biomatters Geneious e
o alinhador Geneious.
Para três das amostras, as cepas /serovar específicos
sequenciados não tinham sequência de referência
NCBI disponível; nesses casos, utilizou-se uma
cepa próxima relativa, o que explica os valores
mais baixos no mapeamento de leituras pela
referência (Alinhamento a RefSeq). Essas amostras
são Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa
e Listeria monocytogenes. Caso contrário, quase
todas as leituras estão mapeando conforme sua
respectiva referência, o genoma está bem coberto
e as notas de confiança são altas. Isso é verdade
em vários tamanhos de genoma, conteúdo
de GC e organização de genomas. É esperada
uma flutuação em cobertura entre amostras.
A cobertura é uma função tanto do número de
leituras alocadas à amostra (Representação de
Índice de MiSeq) como do número de pares de
base que precisam ser cobertos
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Revista NewsLab Edição 166 | Julho 2021