pediatrik yaş grubu çeşitli anemik hastalıkların ayırıcı tanısında ...

(ProsPec, Dade Behring, USA) nefelometrik yöntemle ölçüldü. Kitin normal CRP
değeri ≤ 3,2 mg/L idi.
5. sTfR düzeylerinin ölçümü; serumlar çalışma gününe kadar – 80 °C’de
saklandı. Çalışma kitleri (Biovendor Laboratory Medicine, Inc.) temin edildiğinde
serum sTfR düzeyleri "Sandwich" Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
metodu kullanılarak Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya
Laboratuarında ölçüldü. (96 kuyucuklu plağın her kuyusuna 100 μl sTfR
çözücüsünden eklenildi. Daha sonra her kuyuya standart, örnek veya kontrol
serumun birinden 20 μl eklendi. Çalışmanın bu kısmının 15 dakika içinde bitirilmesi
gerekmekteydi. Plak bir saat oda ısısında karanlıkta ağzı kapatılarak enkübe edildi.
Dört kez yıkama işlemi arkasından bu kez kuyucuklara 100 μl konjügat konularak
yine bir saat enkübe edildi. Süre sonunda yine dört kez yıkama işlemini takip ederek
bu kez substrat solüsyonu eklenerek 30 dakika bekletildi. Son olarak 100 μl stop
solüsyonu eklenerek 30 dakika içinde 450 nm’de okundu). Normal değerleri 8,7 –
28,1 nmol/l olarak belirlenmiştir. sTfR monomerleri 85,000 dalton olduğu için; 1
nmol/l = 1,0 x 10 -6 μmol/ml = 0,085 μg/ml şeklinde hesaplanabilir (119). Kontrol
grubu olarak alınan sağlıklı 10 çocukta serum sTfR düzeyleri ölçüldü ve ortalama
değeri 17,36 ± 5,22 µ/ml (13,32-31,74) bulundu.
6. TNF-α düzeylerinin ölçümü; serumlar çalışma gününe kadar – 80 °C’de
saklandı. Serum TNF-α düzeyleri, Endogen Human TNF-α ELISA kiti (Biosource
International, Inc.) ile Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya
Laboratuarında ölçüldü. (Kontrol ve hasta serum örnekleri çalışmaya başlanmadan
hemen önce derin dondurucudan çıkarılarak erimeye bırakıldı. Daha sonra solid faz
Anti-TNF-α antikorları ile kaplanmış olan 96 kuyucuk içeren mikrotitrasyon
plağının her bir kuyucuğuna 200’er μl standart, kontrol ve hasta serumları konuldu.
Her kontrol ve hasta serumu iki kez çalışıldı. Bunun üzerine 50’şer μl inkübasyon
tamponu eklenerek oda sıcaklığında horizontal karıştırıcıda 2 saat inkübasyona
bırakıldı. İnkübasyon sonunda her bir kuyucuk yıkama sıvısı ile 4 kez yıkandı. Her
kuyucuğa 100’er μl TNF-α konjugattan konuldu ve 2 saat inkübe edildi. İnkübasyon
sonunda yıkama işlemi tekrarlandı. Tüm kuyucuklara 100’er μl substrat
solüsyonundan konularak 30 dakika oda ısısında karanlıkta inkübe edildi. Stop
49