Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule ...

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3.3.7 Durchführung der Histamin-Freisetzung
Alle Histaminfreisetzungen aus basophilen Granulozyten erfolgten aus gewaschenem EDTA-
Blut (3.3.3). Nach dem Waschen des Blutes, was im weiteren auch als Vorbehandlung
bezeichnet wird, wurden folgende Freisetzungsbehandlungen durchgeführt.
3.3.7.1 Spontane Freisetzung von Histamin
Bei der spontanen Freisetzung, welche als Kontrolle dafür dient, wieviel Histamin die Zellen
allein durch die mechanische Behandlung ohne Stimulanz freisetzen, wird den Zellen nur
Freisetzungspuffer zugesetzt. Dieser ersetzt das zuvor durch das EDTA gebundene Calcium
und Magnesium und schafft damit für die basophilen Granulozyten Reaktionsbedingungen,
die es ihnen ermöglichen, Histamin freizusetzen.
250 µl des vorbehandelten Blutes wurden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 250 µl Pipes B
(3.2.2.3) vorsichtig gemischt und anschließend bei 37°C im Brutschrank für 60 min inkubiert.
Danach wurde die Freisetzungsreaktion gestoppt, indem die Probe für 20 min auf Eis
verbracht wurde. Die gekühlten Proben wurden nun bei 700 x g für 10 min bei
Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und für die spätere
Verwendung im RIA bei –20°C eingefroren.
3.3.7.2 Physikalische Freisetzung von Histamin
Um die Menge des Histamins zu erfahren, welches in den Zellen enthalten ist, wurde diese
durch Hitze zerstört. Hierzu wurden 200 µl gewaschene Blutzellsuspension mit 800 µl Pipes
B (3.2.2.3) in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß gemischt. Nachdem in den Deckel des Gefäßes
mit einer Kanüle ein Loch gebohrt wurde, wurde die Probe 10 min bei 100°C im Wasserbad
gekocht. Die nachfolgende Zentrifugation wurde mit 8300 x g für 3 min durchgeführt. Der
partikelfreie Überstand wurde abgenommen und für die Weiterverwendung im RIA bei –20°C
eingefroren.
3.3.7.3 Antikörper induzierte Freisetzung von Histamin
Hierzu wurde der Antikörper Ziege anti Pferd IgG (H+L) verwendet. Den vorbehandelten
Blutzellen wurde der Antikörper in Freisetzungspuffer zugeführt, um zu prüfen, ob dieser in