Comunicazioni orali e Poster sul Monitoraggio biologico - Giornale ...

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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO www.gimle.fsm.it 33 G. Brambilla 1 , F.M. Rubino 1 , S. Pulvirenti 1 , C. Verduci 1 , S. Fustinoni 2 , M. Buratti 2 , A. Colombi 1 Considerazioni sul ruolo dei coniugati mercuro-tiolici nella tossicità cardiovascolare del metallo 1 Dipartimento di Medicina del Lavoro, Clinica L. Devoto, Università degli Studi di Milano, Sezione Ospedale San Paolo 2 Azienda Ospedaliera Istituti Clinici di Perfezionamento RIASSUNTO. Nell’ambito di studi volti a definire i meccanismi molecolari coinvolti nell’azione tossica del mercurio sugli apparati cardiovascolare, nervoso, renale e immunitario, viene discusso il ruolo biologico dei coniugati tiolici che il metallo è in grado di formare con i composti della griglia metabolica del glutatione e con i gruppi tiolici delle proteine funzionali, con particolare riferimento ad un loro coinvolgimento nella perturbazione dei sistemi di signalling intracellulare (formazione di S-nitroso ed S-glutationil emoglobina) dell’apparato cardiovascolare. Parole chiave: mercurio, composti tiolici, meccanismi tossicità, effetti cardiovascolari. ABSTRACT. CONSIDERATIONS ON THE ROLE OF MERCURY THIOL CONJUGATES IN THE CARDIVASCULAR TOXICITY OF MERCURY. Within the framework of current studies aimed at highlighting the molecular basis of the toxicity of mercury for the cardiovascular, nervous, renal and immune systems, we discuss the biological role of mercury conjugates with glutathione compounds and with functional proteins, with reference to their ability to disturb the redox signalling pathways based on S-nitrous and S-glutathionyl hemoglobin. Key words: mercury, thiolic compounds, cardiovascular effects. Introduzione Il mercurio è un metallo la cui tossicità per l’uomo coinvolge organi bersaglio quali il sistema nervoso centrale e il rene. Sono state inoltre espresse preoccupazioni nei confronti dell’eventuale coinvolgimento del mercurio quale agente tossico corresponsabile della comparsa di alterazioni patologiche a carico del sistema nervoso centrale e del sistema neuro-immunitario in soggetti portatori di otturazioni dentarie in amalgama di mercurio e in bambini sottoposti a vaccinazione con vaccini contenenti composti organomercuriali quali agenti conservanti antibatterici. Recentemente inoltre è stato rivalutato il suo possibile ruolo nell’eziopatogenesi di alcune malattie cardiache. Lo studio delle forme chimiche attraverso le quali il mercurio è distribuito nell’organismo ed esercita le azioni tossiche selettive su recettori cellulari specifici degli organi bersaglio rappresenta un attivo campo di ricerca (1,2). In particolare, le forme coniugate del mercurio con i composti appartenenti alla griglia metabolica del glutatione, costituiscono i metaboliti di trasporto epatobiliare sia della specie metilmercurio (MeHg + ) che dello ione mercurico (Hg 2+ ) e sono responsabili dell’accumulo irreversibile del metallo all’interno delle cellule del tubulo renale prossimale, causa prossima della nefrotossicità del mercurio. Tossicità nei confronti del sistema cardiovascolare Già Ramazzini, alla fine del XVII secolo, aveva descritto la morte per ‘sincope’ di lavoratori esposti a vapori di mercurio nella fabbricazione di specchi e nella doratura dei mobili attraverso la spalmatura di amalgami d’argento o d’oro sulle superfici e la successiva evaporazione del mercurio ad elevata temperatura. Numerosi lavori recenti concorrono a razionalizzare queste osservazioni, suggerendo un ruolo specifico del mercurio nella patologia cardiovascolare. È stato infatti osservato un accumulo selettivo di mercurio (concentrazioni di 1-800 µg/g di tessuto) in campioni di tessuto miocardico prelevato dal ventricolo sinistro di pazienti affetti da miocardiopatia dilatativa, mentre quelli di pazienti affetti da altre patologie degenerative del muscolo, quale l’infarto miocardico, e di soggetti normali mostravano valori di 0,05-0,5 µg/g (3). La perfusione del cuore di ratto con un tampone contenente Hg 2+ a concentazione nanomolare è risultata in grado di ridurre la forza di contrazione del muscolo (4); questa osservazione può essere posta in relazione con l’attività inibitoria mostrata dallo ione nei confronti dell’ATP-asi Na + -K + -dipendente ouabaino-sensibile (5). Recenti studi pongono in evidenza il ruolo di un pool di emoglobina collocato in prossimità della membrana cellulare dell’eritrocita nel regolare la vasodilatazione periferica attraverso la formazione reversibile di coniugati nitroso-tiolici tra il residuo tiolico della cisteina β-93 e l’ossido di azoto (NO) circolante (6), responsabile del mantenimento del tono vascolare. Risulta pertanto possibile che la quota intraeritrocitaria di Hg 2+ possa perturbare questo sistema, in quanto in grado di degradare i nitrosotioli (7) e di competere per il legame a queste molecole di emoglobina, anche attraverso la formazione di specie con connettività Hb-( 93 Cys)S-Hg-SGlutatione, che è a sua volta potenzialmente in grado di mimare gli effetti dell’analogo glutationil-emoglobina, una forma post-traduzionale fisiologicamente presente e i cui livelli risultano incrementati in condizioni di stress ossidativo cellulare (8). Reattività dello ione Hg 2+ con composti bio-organici contenenti gruppi tiolici liberi Il mercurio dà origine a ‘sali’ con amminoacidi, peptidi e proteine contenenti residui di cisteina, secondo il processo descritto nell’equazione 1 seguente: Hg2+ + R1-SH ↔ R1-S-Hg + + H + R1-S-Hg + + R2-SH ↔ R1-S-Hg-S-R2 + H + (1) ovvero: Hg2+ + 2 R-SH ↔ R-S-Hg-S-R + 2 H + I valori delle costanti di equilibrio per sistemi contenenti il glutatione o la penicillamina sono risultati estremamente elevati (superiori a 10 30 ), tali da dover ammettere che, in ambiente biologico ed in presenza delle concentrazioni fisiologiche di gruppi tiolici liberi, non possano sussistere in pratica ioni Hg 2+ liberi. Il trasporto dello ione Hg 2+ tra i diversi compartimenti biologici avviene quindi attraverso lo scambio dei loro residui tiolici (equazione 2): R 1 -S-Hg-S-R 1 + R 2 -SH ↔ R 1 -S-Hg-S-R 2 + R 1 -SH (2) Alcuni aspetti della reattività dei coniugati mercuro-tiolici sono stati inoltre desunti sulla base delle reazioni di frammentazione osservate mediante spettrometria di massa (9). In particolare, è stata evidenziata la possibilità che specie mercuro-cisteiniche diano origine a intermedi alchilanti di tipo episulfonio, in grado di modificare irreversibilmente le strutture biologiche. È possibile pertanto ricondurre, almeno in termini ipotetici, il mec-
COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl 34 www.gimle.fsm.it canismo dell’azione tossica selettiva del mercurio all’interazione tra Hg 2+ e specifici bio-tioli che partecipano a sistemi di signalling cellulare, quali non solamente i gruppi tiolici funzionali degli enzimi, ma anche le proteine nitrosilate e glutationilate, nonché alcuni mediatori neuroendocrini di natura peptidica, quali la vasopressina e l’ossitocina, coinvolti in una vasta serie di fenomeni biologici di regolazione. Conclusioni In conclusione, le conoscenze oggi in via di acquisizione sulla reattività del mercurio nei confronti di amminoacidi, peptidi e proteine contenenti gruppi tiolici liberi o ponti disolfuro possono rendere ragione, almeno in termini speculativi, degli effetti biologici del metallo su organi ed apparati dell’organismo umano noti per essere bersagli elettivi della sua azione tossica. Bibliografia A. Caglieri 2 , M.V. Vettori 1,2 , M. Goldoni 1,2 , R. Alinovi 2 , D. Poli 1,2 , S. Ceccatelli 3 , A. Mutti 2 RIASSUNTO. In questo lavoro vengono presentate le variazioni dei livelli di indicatori specifici di stress ossidativo misurati in una coltura cellulare neuronale (SK-N-MC) esposta a stirene e 7,8-ossido (SO), 0.3 e 1mM per 16 ore. Il trattamento con SO provoca un significativo aumento della perossidazione lipidica associato all’incremento dei livelli di ossidazione del DNA e delle proteine. Inoltre l’esposizione a SO determina la diminuzione dell’attività della GST, il calo di GSH (solo alla concentrazione più alta) e l’incremento dell’attività dell’HO-1. Parole chiave: stress ossidativo, danno al DNA, stirene 7,8-ossido, cellule neuronali. ABSTRACT. OXIDATIVE STRESS IN HUMAN NEURONAL CELLS INDU- CED BY STYRENE 7,8-OXIDE. In this study, we report the alterations of several markers of oxidative stress measured in a neuronal cell line (SK-N- MC) exposed to styrene 7,8-oxide (SO), 0.3 and 1 mM for 16 h. SO treatment induced a significant increase in lipid peroxidation associated with an increase in the oxidation levels of DNA and proteins. In addition, SO exposure caused the reduction in GSH levels (only at the 1 mM dose), GST activity and an increased heme oxygenase (HO-1) activity. Key words: oxidative stress, DNA damage, styrene 7,8-oxide, neuronal cells. Introduzione Lo stirene è un composto organico volatile molto utilizzato a livello industriale. L’esposizione a stirene provoca alterazioni neurocomportamentali nei lavoratori, quali perdita di memoria, fatica, cambiamenti d’umore e modificazioni neurologiche che talvolta diventano permanenti (1-3). Ad oggi i meccanismi dei danni provocati sul sistema nervoso centrale (SNC) dallo stirene non sono stati completamente identificati. Lo stirene 7,8-ossido (SO), il principale metabolita dello stirene, è citotossico per linee cellulari neuronali in vitro (4-6). In un recente lavoro è stata dimostrata l’azione tossica dello SO in cellule di neuroblastoma umano (SK-N-MC) ed in una cultura pri- 1) Sirois & Atchison: Neurotoxicology 1996; 17: 63-84. 2) RK Zalups: Pharmacol Rev 2000; 52: 113-43. 3) Frustaci A, Magnavita N, Chimenti C, Caldarulo M, Sabbioni E, Pietra R, Cellini C, Possati GF, Maseri A. J. Am. Coll. Cardiol. 1999, 33: 1578-1583. 4) Souza de Assis G, Cunha Silva CE, Stefanon I, Vassallo DV. Comp Biochem Physiol C 2003; 134: 375-83. 5) Bhattacharya S, Bose S, Mukhopadhayay B, Sarkar D, Das D, Bandyopadhayay J, Bose R, Majumdar C, Mondal S, Sen S. BioMetals 1997; 10: 157-63. 6) Stamler JS, Jia L, Eu JP, McMahon TJ, Demchenko IT, Bonaventura J, Gernert K, Piantadosi CA. Science 1997; 276: 2034-37. 7) Swift HR, Williams DLH. J Chem Soc Perkin Trans 1997; 2: 1933-35. 8) Bursell SE, King GL. Clin Chem 2000; 46: 146-46. 9) Rubino FM, Verduci C, Giampiccolo R, Pulvirenti S, Brambilla G, Colombi A. J Am Soc Mass Spectrom 2004; 15: 288-300. Analisi dello stress ossidativo indotto dallo stirene 7,8-ossido in cellule neuronali umane 1 Centro Studi e Ricerche ISPESL, Università degli Studi di Parma 2 Laboratorio di Tossicologia Industriale, Università degli Studi di Parma 3 Institute of Environmental Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Svezia maria di granulociti cerebellari (7). Queste linee cellulari esposte a diverse concentrazioni di SO manifestano contrazione cellulare, riarrangiamenti cromatidici ed attivazione di alcune proteasi (calpaina e caspasi), eventi caratteristici della “fase esecutiva” dell’apoptosi (7). Scopo dello studio è di chiarire i meccanismi dell’azione citotossica dello SO nella linea cellulare SK-N-MC ipotizzando che l’esposizione provochi stress ossidativo e questo possa determinare l’attivazione di enzimi specifici per la morte cellulare. Poiché il trattamento delle cellule SK-N-MC con SO 0,3 e 1 mM per 16 ore determina l’attivazione di segnali apoptotici come il riarrangiamento cromatidico e l’aumento dell’attività delle caspasi (7), queste stesse concentrazioni sono state scelte per valutare anche i parametri di stress ossidativo. Materiali e metodi Per chiarire quali siano gli eventi intracellulari che determinano la morte delle cellule neuronali, sono stati valutati i seguenti indicatori specifici per i diversi bersagli cellulari dello stress ossidativo nella linea di neuroblastoma umano SK-N-MC: 1. le sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS), come parametro del danno ossidativo alle membrane cellulari; 2. i gruppi carbonilici e gruppi sulfidrilici per valutare l’ossidazione proteica; 3. i livelli di 8-idrossi-2’-desossiguanosina (8-OHdG), indicatore del danno al DNA; 4. l’espressione e l’attività dell’eme-ossigenasi (HO-1) come esempio di una risposta al danno ossidativo mediato dalla regolazione genica. Sono stati inoltre stimati altri indicatori per valutare la capacità di “scavenging” delle cellule: i livelli di glutatione intracellulare (GSH) e l’attività della glutatione S-transferasi(GST).
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