Comunicazioni orali e Poster sul Monitoraggio biologico - Giornale ...

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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO www.gimle.fsm.it 107 Conclusioni I risultati preliminari di questo studio indicano che a basse esposizioni professionali (attività non continuative di saldatura di metalli ferrosi) il MnU non è un indicatore biologico idoneo per il monitoraggio di singoli soggetti e neppure di gruppi di lavoratori. Bibliografia 1) Apostoli P, Lucchini R, Alessio L. Are current biomarkers suitable P. Tomao, M.C. D’Ovidio, S. Di Renzi, C. Grandi for the assessment of manganese exposure in individual workers?. Am J Ind Med 2000; 37: 283-290. 2) Gobba FM, Galassi C, Minoia C et al. Biological monitoring of occupational manganese exposure in steel welding operations. Arch Sci Lav 1988; 4: 91-98. 3) Lucchini R. Apostoli P, Perrone C et al. Long term exposure to “low level” of manganese oxides and neurofunctional changes in ferroalloy workers. Neurotoxicology 1999; 20: 287-298. 4) Roels H, Ghyselen P, Buchet JP et al. Assessment of the permissible exposure level to manganese in workers exposed to manganese dioxide dust. Br J Ind Med 1992; 49: 25-34. 5) Minoia C, Apostoli P. 1 a lista SIVR dei valori di riferimento definizioni, criteri metodologici e strategie analitiche. G Ital Med Lav Erg 2003; 25: 1. Valutazione del danno al DNA in cellule umane dell’epitelio nasale esposte ad ossido di etilene ISPESL, Dipartimento di Medicina del Lavoro, Monteporzio Catone (RM) RIASSUNTO. Nella medicina del lavoro il comet test (CT) ha ricevuto in questi ultimi anni un’elevata considerazione quale metodica rapida, semplice e poco costosa per lo studio dell’attività genotossica di sostanze. L’ossido di etilene, gas infiammabile ed incolore, classificato dalla IARC nel gruppo 1, può essere assorbito dall’uomo attraverso il tratto respiratorio e la cute. Scopo del lavoro è valutare la sensibilità del CT nel misurare il danno al DNA in cellule dell’epitelio nasale (RPMI 2650) esposte in vitro a diverse concentrazioni di ossido di etilene. Lo studio ha evidenziato l’appropriatezza della strategia sperimentale utilizzata, fornendo una valutazione degli effetti dell’ossido di etilene sul DNA del tutto paragonabili a quelli ottenuti con metodiche convenzionali quali le aberrazioni cromosomiche e il test del micronucleo. Inoltre le prove condotte hanno mostrato una maggiore sensibilità del CT, in quanto è stato evidenziato un danno al DNA anche a dosi di EtO più basse di quelle rilevabili con gli altri test. Parole chiave: comet test, ossido di etilene, esposizione in vitro. ABSTRACT. DNA DAMAGE IN HUMAN NOSE EPITHELIAL CELLS EX- POSED TO ETHYLENE OXIDE. In recent years the comet test has been highly regarded in occupational medicine as a rapid, simple and inexpensive technique for detecting substances with genotoxic activity. Ethylene oxide is a colourless flammable gas, classified in group 1 by IARC, which can be absorbed through the respiratory tract and the skin. The aim of this study is to evaluate the capcity of the comet test to measure DNA damage in epithelial nasal septum cells (RPMI 2650) exposed to ethylene oxide. The effect of ethylene oxide on DNA can be evaluated by the comet test, yielding comparable results to those obtained using well-established techniques such as chromosomal aberration and micronucleus formation analyses. Moreover, the comet test was more sensitive than the other tests, showing DNA damage at lower doses than those detectable by chromosomal aberration and micronucleus formation. Key words: comet test, ethylene oxide, in vitro exposure. Introduzione In medicina del lavoro è fondamentale il monitoraggio dell’esposizione a sostanze potenzialmente mutagene e/o cancerogene. Aspetti critici del monitoraggio sono i tempi, le procedure e la rappresentatività del campionamento, la sensibilità e la specificità dei metodi analitici, i tempi di esecuzione delle analisi e i costi. Fondamentale al riguardo è la disponibilità di test di genotossicità adeguati. Tra le metodiche utilizzate per studiare l’attività genotossica di sostanze, il Comet Test (CT) ha, in questi ultimi anni, riscontrato approvazione anche nel campo della medicina del lavoro. Tale test prevede l’inglobamento in agarosio delle cellule trattate con la sostanza, la loro lisi e la corsa elettroforetica del lisato cellulare durante la quale si ha la migrazione del DNA, visualizzata tramite un colorante fluorescente. Il grado di migrazione del DNA, in condizioni alcaline, viene ad essere considerato proporzionale alla frequenza degli eventi di rottura in singole cellule esposte alle sostanze genotossiche. Il parametro considerato maggiormente significativo per quanto riguarda la rilevazione delle rotture del filamento di DNA è il momento di coda (Tail Moment - TM), definito come il prodotto dell’intensità di fluorescenza relativa della coda della cometa per la sua lunghezza. L’ossido di etilene (EtO) è un gas infiammabile e incolore con un caratteristico odore simile all’etere. In condizioni di pressione elevata può presentarsi come un liquido volatile. È completamente miscibile con acqua e molti solventi organici. Si tratta di una sostanza mutagena e cancerogena (gruppo 1 della classificazione IARC), che viene assorbita attraverso il tratto respiratorio e la cute. Il meccanismo d’azione è noto nel dettaglio, con la formazione di addotti al DNA ben caratterizzati. Viene comunemente utilizzato come intermedio di sintesi nell’industria chimica e come agente sterilizzante in ambiente sanitario e nell’industria alimentare. L’esposizione dei lavoratori a EtO nei diversi settori di impiego della sostanza varia considerevolmente, fino a raggiungere in alcune condizioni valori elevati. Scopo del lavoro è valutare la sensibilità del CT nel misurare il danno al DNA in cellule dell’epitelio nasale esposte a diverse concentrazioni di ossido di etilene. I risultati ottenuti con tale metodica, rapida e poco costosa, possono essere confrontati con quelli ottenuti da altri autori, con metodiche differenti, soprattutto in termini di riproducibilità del dato e possibilità di evidenziare un effetto anche a dosi basse. Materiali e metodi È stato analizzato, mediante il CT, l’effetto dell’EtO nella linea cellulare di epitelio nasale umano RPMI 2650. Le cellule della cavità nasale sono le prime cellule esposte agli inquinanti e costituiscono la prima linea di difesa dell’organismo nei confronti di xenobiotici introdotti per via inalatoria: rappresentano infatti un sito target ben conosciuto per un ampio range di mutageni e sono quindi adatte per lo sviluppo di biomarcatori di esposizione/effetto. Le cellule sono state fatte crescere in monostrato e mantenute in terreno Minimum Essential Medium (MEM) con sali di Eagle, addi-
COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl 108 www.gimle.fsm.it zionato con siero bovino fetale (FCS) al 10%, antibiotici, glutamina ed amminoacidi non essenziali all’1%. L’EtO disciolto in metanolo (MEOH 50.000 UG/ML, Supelco) è stato diluito alle concentrazioni d’uso (0,5-100 mM) in terreno per cellule senza FCS. Le diluizioni delle sostanze sono state preparate al momento degli esperimenti, alla temperatura di 0-5°C. Sono stati effettuati esperimenti preliminari di tossicità per valutare le concentrazioni di sostanza che non perturbano la sopravvivenza e la crescita cellulare. Dopo il trattamento con diverse concentrazioni di EtO le cellule sono state osservate al microscopio per evidenziare eventuali cambiamenti morfologici e successivamente è stata valutata la citotossicità mediante l’utilizzo di un colorante vitale (rosso neutro), la cui incorporazione è stata misurata spettrofotometricamente. Il CT è stato condotto subito dopo il trattamento delle cellule con la sostanza (tempo zero), dopo 3 ore e dopo 24 ore, sia per valutare l’effetto genotossico che per monitorare la cinetica del riparo. Tutti gli esperimenti sono stati condotti solo quando la vitalità delle cellule, valutata tramite il test di esclusione del colorante vitale trypan blu, era > 75%. I risultati sono rappresentativi della media di tre esperimenti. Risultati Il CT, effettuato subito dopo l’esposizione delle cellule RPMI 2650 a EtO nel range di 5,0-50,0 mM e dopo 3 e 24 ore ha mostrato, in tutte le condizioni sperimentali, un aumento dose-dipendente nella migrazione del DNA (TM) e una cinetica di riparo che evidenzia come dopo 24 ore, solo circa il 15% delle rotture viene riparato. Per quanto riguarda invece il trattamento delle cellule a concentrazioni più basse (0,5-4,0 mM) sono stati ottenuti risultati differenti. Il valore del TM varia in modo non significativo, dalle concentrazioni più basse a quelle più alte, nelle condizioni di esecuzione del test al tempo zero. Tuttavia, nei campioni sottoposti al CT dopo 3 ore e 24 ore dal trattamento, è stato riscontrato un aumento significativo del TM rispetto alle cellule di controllo. Discussione Gli effetti genotossici prodotti da sostanze alchilanti il DNA, come l’ossido di etilene, possono essere studiati attraverso l’impiego di diverse metodiche. Poiché il danno al DNA indotto da agenti tossici dipende in molti casi dal tipo di cellula o di tessuto, il CT, utilizzato nello studio, può rappresentare un eccellente metodo in grado di rilevare il danno in cellule singole in diverse condizioni sperimentali. Recentemente questa metodica è stata ampiamente utilizzata per studiare gli effetti dell’esposizione a sostanze genotossiche anche nei linfociti di lavoratori esposti. Lo studio ha evidenziato l’appropriatezza della strategia sperimentale utilizzata, fornendo una valutazione degli effetti dell’EtO sul DNA del tutto paragonabili a quelli ottenuti con metodiche convenzionali quali le aberrazioni cromosomiche e il test del micronucleo. Inoltre le prove condotte hanno mostrato una maggiore sensibilità del CT, in quanto è stato evidenziato un danno al DNA anche a dosi di EtO più basse di quelle rilevabili con gli altri test. Infine, considerando che nei campioni analizzati dopo 3 e 24 ore dal trattamento delle cellule con la sostanza alle concentrazioni più basse si rileva un aumento del danno e che anche alle concentrazioni più elevate quest’ultimo è scarsamente riparato, è ipotizzabile che, dopo un iniziale periodo di latenza, la lesione iniziale (formazione di addotti) si traduca nell’induzione di rotture a doppio filamento. Queste ultime, come è noto, presentano una bassa efficienza di riparo e costituiscono il tipo di lesione più critico ai fini di una potenziale evoluzione in senso neoplastico. Bibliografia 1) Babich H, Borenfreund E. Cytotoxicity of T-2 toxin and its metabolites determined with the neutral red cell viability assay. Appl. Environ. Microbiol. 1991; 57: 2101-2103. 2) Dellarco VL, Generoso WM, Sega GA, Fowle III J, Jacobson-Kram D. Review of the mutagenicity of ethylene oxide. Environ. Mol. Mutagen. 1990; 16: 85-103. 3) Nygren J, Cedervall B, Eriksson S, Dusinska M, Kolman A. Induction of DNA strand breaks by ethylene oxide in human diploid fibroblasts. Environ. Mol. Mutagen. 1994; 24: 161-167. 4) Salama SA, Serrana M, Au WW. Biomonitoring using accessibile human cells for exposure and health risk assessment. Mutat. Res. 1999; 436: 99-112. P. Travaglini 1 , A. D’Intino 1 , L. Di Giampaolo 1 , I. Di Zio 1 , M. Di Gioacchino 1 , M. L. Castellani 2 , M. Reale 2 , J. Ponti 3 , E. Sabbioni 3 , P. Boscolo 1 Studio in vitro sull’immunotossicità dei metaboliti dell’arsenico inorganico 1 Sezione di Medicina del Lavoro, Allergologia ed Immunologia Clinica, Dipartimento di Medicina e Scienze dell’Invecchiamento, Università “G. D’Annunzio”, Chieti 2 Dipartimento di Neuroscienze ed Oncologia, Università “G. D’Annunzio”, Chieti 3 ECVAM, Joint Research Centre, Ispra RIASSUNTO. Oggetto di questa ricerca erano gli effetti di composti arsenicali sulla proliferazione di PBMC umane stimolata da PHA e sul loro rilascio di IFN-γ e TNF-α in presenza di sali arsenicati. Gli effetti inibitori dei composti 10 -4 e 10 -5 M era nel seguente ordine: acido momometil-arsenioso (MMAs III ), As(III), As(V), acido dimetil-arsinico (DMAs V ), acido monometil-arsonico (MMAs V ). Inoltre basse dosi (da 10 -7 a 10 -8 M) di As(III), MMAs III e DMAs V stimolavano la risposta immunitaria. Questo studio dimostra che l’immunotossicità dell’As inorganico in parte dipende dalla biosintesi di MMAs III , metabolita successivamente trasformato in DMAs V . Parole chiave: arsenico, composti metilati, immunotossicità. ABSTRACT. IN VITRO STUDY ON THE IMMUNOTOXICITY OF METABO- LITES OF INORGANIC ARSENIC. The aim of this in study was to evaluate the effects of As compounds on PHA stimulated PBMC proliferation and IFN-γ and TNF-α release. The inhibitory effect of 10 -4 and 10 -5 M As compounds was in the following order: momo-methyl-arsenous acid (MMAs III ) > As(III) > As(V) > dimethyl arsinic acid (DMAs V ) > monomethyl-arsonic acid (MMAs V ). Moreover, low doses (from 10 -7 to 10 -8 M) of As(III), MMAs III and DMAs V stimulated the immune response. This study shows that the immunotoxicity of inorganic arsenic in part depends on bio-synthesis of MMAs V into MMAs III , which is subsequently transformed in DMAs V . Key words: arsenic, methylated compounds, immunotoxicity.
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