Comunicazioni orali e Poster sul Monitoraggio biologico - Giornale ...

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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presentato dalla messa a punto di biosensori per la determinazione
diretta di agenti biologici nell’aria ambiente.
Biosensori per la determinazione di agenti biologici
Per biosensore si intende un dispositivo analitico costituito da
un elemento sensibile di natura biologica (sensore) accoppiato ad
un trasduttore di segnale. Il sensore può essere rappresentato da
un enzima che catalizza una specifica reazione che coinvolge la
molecola dell’analita, da un anticorpo che lega in modo specifico
la molecola dell’analita, da cellule batteriche in grado di utilizzare
l’analita come substrato, da sequenze oligonucleotidiche in grado
di legare sequenze complementari o di subire modificazioni
chimiche a contatto con alcune classi di analiti (genotossici), etc.
Il trasduttore è interfacciato direttamente all’elemento sensibile
ed è in grado di convertire il segnale biochimico di quest’ultimo
in un segnale di tipo diverso, elettrico o ottico (elaborato e visualizzato
su display o trasmesso a postazioni remote). I vantaggi potenziali
connessi all’impiego di biosensori nelle determinazioni
analitiche sono riassumibili in: 1) elevata specificità e sensibilità;
2) rapidità di risposta; 3) eliminazione della fase di pretrattamento
del campione; 4) possibilità di determinazione ripetute o, al limite,
in continuo; 5) compattezza e portatilità del dispositivo; 6) possibilità
di trasmissione dei dati a distanza on line; 7) costi ridotti.
Numerose rassegne sono disponibili in letteratura sullo stato
dell’arte o sugli sviluppi di ricerca per quanto riguarda specifici
ambiti di impiego (fondamentalmente clinico, del controllo alimentare
e della ricerca di inquinanti nelle acque e dei suoli) o categorie
di biosensori (4, 5). Relativamente a biosensori per rilevare
microrganismi, virus e agenti biologici in generale l’ambito
che ha ricevuto maggior impulso è quello legato alla sicurezza
alimentare, in relazione all’identificazione di contaminazioni microbiche
di alimenti come latte e carni da parte di specie quali E.
coli e Salmonella. Anche le acque reflue (controllo ambientale) e
i fluidi biologici (diagnostica clinica) sono sempre più oggetto di
ricerca in relazione alla messa a punto di biosensori per l’identificazione
e la quantificazione di agenti biologici (6).
I biosensori per agenti biologici allestiti fino ad ora sono riconducibili
a due fondamentali classi: ad anticorpi e ad acidi nucleici.
In relazione ai primi si dispone dell’esperienza più consolidata.
Anticorpi specifici nei confronti di antigeni di superficie
(proteine batteriche e/o virali) sono immobilizzati su supporto e
accoppiati ad un sistema di trasduzione. Le prestazioni, soprattutto
in termini di sensibilità, di intervallo dinamico e di rigenerazione
dell’elemento sensibile sono molto variabili, in relazione
alla natura del complesso antigene-anticorpo, al sistema di trasduzione
e alla matrice di indagine. In alcuni casi sono confrontabili
con quelle di metodi ormai consolidati (es. saggio ELISA)
o addirittura superiori (7). Attualmente la messa a punto di sensori
capaci di operare in aria è ostacolata dalla necessità della
presenza di una matrice liquida a livello della quale possa avvenire
il legame antigene-anticorpo.
I biosensori ad acidi nucleici hanno una struttura di base costituita
da sequenze oligonucleotidiche a singolo filamento immobilizzate
su supporto (che può fungere o meno da trasduttore). Il legame
a dette sequenze di sequenze complementari o di parti di sequenze
complementari (sequenze target) determina una modificazione
(aumento di massa, variazione di potenziale, variazione della
frequenza basale di oscillazione) che può essere trasdotta in segnale
elettrico o ottico. Le problematiche operative connesse alla
preparazione di sensori ad acidi nucleici (genosensori) sono state
recentemente prese in rassegna (8). La sequenza complementare da
rilevare è costituita nella maggior parte dei casi dalla sequenza di
un gene caratteristico di una determinata specie o ceppo microbico
o da una sequenza di DNA virale. Di solito il sensore è accoppiato
con un elettrodo, ma sono stati realizzati sensori a DNA abbinati a
sistemi di trasduzione diversi. I biosensori ad acidi nucleici hanno
il vantaggio di un’elevatissima specificità e richiedono tempi ridotti.
Possono però presentare problemi per quanto riguarda la rigenerazione
dell’elemento sensibile: è infatti necessario dissociare
l’ibrido formatosi tra la sequenza bersaglio e la sequenza sensing.
Idealmente la sensibilità di questi dispositivi consente di rilevare la
presenza di una singola sequenza target presente nella matrice liquida.
La sequenza bersaglio deve però trovarsi libera nel mezzo:
ciò implica di solito la necessità di una fase di estrazione degli acidi
nucleici dalle cellule batteriche o dalle particelle virali. L’estrazione
potrebbe non essere necessaria se nel mezzo è presente acido
nucleico libero derivato da morte e sfaldamento di alcuni dei
corpi cellulari batterici o da disgregazione di particelle virali. In secondo
luogo, per la maggior parte dei sistemi realizzati finora è in
pratica necessaria una fase di amplificazione preanalitica della sequenza
bersaglio eventualmente presente tramite PCR. Infine la sequenza
bersaglio deve essere a singolo filamento, allo scopo di permettere
l’ibridazione con la sequenza sensing: ciò implica una fase
di denaturazione post-amplificazione.
Conclusioni
Il panorama tracciato è in rapida evoluzione. La miniaturizzazione
dei dispositivi e l’ottimizzazione delle fasi di realizzazione
e montaggio della componentistica stanno portando anche
ad una progressiva contrazione dei costi. Nell’insieme i sensori a
DNA per agenti biologici realizzati assicurano per ora un importante
vantaggio: l’eliminazione della corsa elettroforetica degli
amplificati e della successiva identificazione delle bande, con sostanziale
riduzione dei tempi di analisi e della dotazione strumentale
necessaria.
Un ambito gravido di rapidi sviluppi è rappresentato dalla
realizzazione di sensori multisequenza tramite l’allestimento di
DNA arrays, in grado di rilevare simultaneamente più sequenze
di acido nucleico e quindi potenzialmente più di un agente biologico
in contemporanea. L’altro ambito (di difficile percorso ma
fortemente innovativo) è dato dall’allestimento di sensori a DNA
per la determinazione di sequenze di acido nucleico libere in aria,
indispensabile sulla base dell’insieme delle considerazioni fin qui
formulate per il monitoraggio di agenti microbici, inclusi quelli
responsabili di infezioni nosocomiali. Dai dati emersi fino ad oggi
per entrambe le categorie di biosensori (ad acido nucleico o ad
anticorpi) si evidenziano in ogni caso prospettive interessanti a
fronte delle criticità riscontrate.
Bibliografia
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