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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO www.gimle.fsm.it 61 questa tecnica sottostimi la reale prevalenza di infezione attuale o pregressa. Infatti, nonostante non sia stata ancora indagata la presenza di DNA virale nei MMs dello studio, sulla base dei dati di letteratura (1, 3-6) si può ipotizzare che almeno il 50% dei pazienti italiani con MM abbiano avuto un contatto con il virus. Supponendo che la verifica con PCR dia i risultati attesi, è possibile avanzare alcune ipotesi riguardo il significato biologico dei dati del presente studio. Nelle scimmie, al contrario di quanto accade nei roditori, a seguito di infezione con SV40 non si osservano titoli elevati di anticorpi a meno che tali animali non siano infettati con quantità molto alta di virus. Analogamente si può ipotizzare che nella specie umana all’infezione con SV40, qualunque sia la via di ingresso, non faccia seguito una produzione di LTAg quantitativamente sufficiente per stimolare una risposta immunitaria. Il virus si comporterebbe in vivo come si osserva in vitro, dove si replica a bassi livelli nelle cellule mesoteliali permettendo così la permanenza nella cellula ospite con la piena espressione delle sue capacità oncogene. Concludendo, la determinazione del titolo anticorpale anti- LTAg con la tecnica dell’IFI, non può essere proposta come metodo di screening per l’individuazione di una popolazione di soggetti infettati da SV40. Infatti, questa tecnica, pur garantendo un’elevata specificità ed un costo contenuto, risulta dotata di scarsa sensibilità. Ringraziamenti Questo lavoro è stato finanziato dall’ISPESL. Si ringrazia l’Unità di Epidemiologia Occupazionale ed Ambientale del CSPO di Firenze. Bibliografia M.E. Fracasso 1 , P. Franceschetti1 , D. Doria 1 , E. Quintarelli 2 , P. Noris 2 , F. Brugnone 2 , L. Romeo 2 1) Cristaudo A, Foddis R, Vivaldi A, Buselli R, Gattini V, Guglielmi G, Banchini L, Bigdeli L, Ottenga F. SV-40 può riverlarsi come un fattore cocancerogeno dell’amianto per lo sviluppo del mesotelioma maligno? Folia Med 2000; 71 (3): 327-333. 2) Jasani B, Cristaudo A, Emri, SA, Gazdar AF, Gibbs A, Krynkska B, Miller C, Mutti L, Radu C, Tognon M, Procopio A. Association of SV40 with human tumours. Seminar Cancer Biol 2001; 11: 49-61. 3) Cristaudo A, Vivaldi A, Sensales G, Guglielmi G, Ciancia E, Elisei R, Ottenga F. Molecular biology studies on mesothelioma tumor samples: preliminary data on HRas, P21 and SV-40. J Environ Pathol Toxicol Oncol 1995; 14: 29-34. 4) Foddis R, Vivaldi A, Ciancia EM, Guglielmi G, Buselli R, Ottenga F, Gattini V, Cristaudo A. Biomolecular studies in the field of occupationa cancer. Atti del Congresso Internazionale “Collaboration between east and west: new european frontiers in occupational medicine”, Pisa, 3-4 december 1998, pp. 110-114. 5) Cristaudo A, Powers A, Vivaldi A, Foddis R, Guglielmi G, Gattini V, Buselli R, Sensales G, Ciancia E, Ottenga F. SV 40 can be reproducibly dectected in paraffin-embedded mesothelioma samples. Anticancer Res 2000; 20 (2A): 875-877. 6) Fisher SG, Weber L, Carbone M. Cancer risk associated with simian virus 40 contaminated polio vaccine. Anticancer Res 1999; 19 (3B): 2173-2180. 7) Cristaudo A. Detection of SV40 sequences in pleural mesothelioma: this evidence could play a preventive role in occupational medicine. The University of Chicago Gleacher Center, Chicago II, 20-21 april 2001. 8) Butel JS, Wong C, Vilchez RA, Szucs G, Domok I, Kriz B, Slonim D, Adam E. Detection of antibodies to polyomavirus SV40 in two central European countries. Cent Eur J Public Health 2003; 11: 3-8. Valutazione di danno e riparo del DNA mediante comet assay in linfociti di soggetti non-fumatori ed ex-fumatori esposti a fumo passivo 1 Dipartimento di Medicina e Sanità Pubblica, Sezione di Medicina del Lavoro, Università di Verona 2 Sezione di Farmacologia, Sezione di Medicina del Lavoro, Università di Verona RIASSUNTO. Il comet assay è un metodo che è in grado di riconosce varie forme di danni al DNA in singole cellule e può valutare la loro capacità riparativa. I linfociti di fumatori presentano danni al DNA significativamente superiori ai controlli, ed il danno è correlato con il numero di sigarette fumate. Il danno cellulare è presente anche nei soggetti esposti a fumo passivo (ex- e non-fumatori). La capacità di riparare i danni indotti dall’H 2 O 2 è gravemente ed ugualmente compromessa nei fumatori attivi e passivi. Parole chiave: danno al DNA, riparazione del DNA, test della cometa, fumo passivo. ABSTRACT. ASSESSMENT OF DNA DAMAGE AND REPAIR BY THE COMET ASSAY IN LYMPHOCYTES OF NON-SMOKERS AND EX-SMOKERS EX- POSED TO ENVIRONMENTAL TOBACCO SMOKE. Assessment of DNA damage and repair by comet assay in peripheral blood lymphocytes of nonsmokers and ex-smokers exposed to passive smoking. DNA damage was assessed in the lymphocytes of active and passive smokers by comet assay. Smokers, as well as passive smokers, showed higher basal DNA damage compared to a control group. The cellular damage was significantly correlated with smoking habits. The lymphocyte capacity to repair H 2 O 2 -induced damage was seriously decreased in both groups, while the same damage in the control lymphocytes was repaired in a short time. Key words: DNA damage, DNA repair, comet assay, environmental tobacco smoke. Introduzione Il fumo passivo o involontario consiste in una miscela di fumo esalato dal fumatore e di fumo liberato dalla sigaretta accesa, che viene diluito nell’aria ambientale (secondhand smoke o environmental tabacco smoke). Il fumo passivo o involontario contiene carcinogeni inalanti altamente volatili come il benzene, l’1,3-butadiene, il benzo(α)pirene, il 4-metilnitrosamina, l’1,3-piril-1-butanone e molti altri, ed è anche costituito da una fase di particolato disperso nell’aria ambientale (1). La cotinina ed il composto parente, la nicotina, sono considerati attendibili biomarcatori di esposizione, soprattutto in caso di recente esposizione (2). Nell’uomo il fumo passivo è associato a mutagenicità urinaria ed è stata dimostrata una correlazione tra mutagenicità urinaria e concentrazione di cotinina nelle urine di soggetti esposti (3). Un metodo particolarmente sensibile che dà informazioni su esposizioni biologicamente attive è il test della cometa che riconosce varie forme di danni al DNA in singole cellule (rotture in singolo e/o doppio filamento, eventi di inefficienza nei processi riparativi) (4). L’attività riparativa è un meccanismo di difesa presente in tutte le cellule, ed è noto che la capacità di riparare i
COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl 62 www.gimle.fsm.it danni del DNA è strettamente legata alla suscettibilità soggettiva di sviluppare tumori. Recentemente, la versione del comet test a pH alcalino si è rivelata particolarmente utile nel valutare simultaneamente danni al DNA e capacità di riparo in campioni biologici di facile reperibilità come i linfociti (5). In base a queste considerazioni e sull’esperienza acquisita nel nostro laboratorio nelle diverse applicazioni di tale test, è stato condotto uno studio rivolto alla valutazione del danno e dell’efficienza riparativa del DNA in linfociti di soggetti non-fumatori, fumatori e fumatori passivi (non- ed ex-fumatori). I linfociti, dopo aver registrato i parametri basali di danno, vengono opportunamente trattati in vitro con H 2 O 2 e successivamente sulle cellule, messe in condizioni di poter riparare i danni subiti, viene determinata una cinetica di capacità riparativa. Materiali e metodi Lo studio è stato eseguito su linfociti di 165 soggetti sani, lavoratori d’ufficio (29-56 anni). Di questi, 41 erano fumatori (21±8 sigarette/die), 47 non fumatori (controlli) e 67 esposti a fumo passivo (43 non- e 24 ex-fumatori). Ciascun soggetto ha compilato un questionario in cui venivano registrati modalità e durata dell’abitudine al fumo, durata di esposizione a fumo passivo, abitudini alimentari. L’esposizione a fumo attivo e passivo è stata verificata determinando la nicotina e cotonina urinarie. Il danno al DNA indotto dall’esposizione è stato stimato mediante comet test in linfociti isolati da sangue intero eparinizzato. Dopo aver eseguito la conta e la vitalità cellulare, i linfociti sono stati stratificati su un vetrino con tecnica “sandwich”, quindi sottoposti ad elettroforesi submarine. I parametri di danno sono stati valutati al microscopio in fluorescenza mediante softwere (Comet Assay II, Perceptive Instruments, UK). Ogni cellula danneggiata si presenta come una cometa con testa e coda. La lunghezza e l’intensità di fluorescenza della coda sono correlate al danno del DNA. I parametri caratterizzanti il danno considerati sono: il numero di comete, la lunghezza della coda (TL), % di DNA nella coda (TI), tail moment (TM); quest’ultimo è il prodotto integrato dei due precedenti parametri. Per ogni soggetto sono state lette 50 cellule random in due esperimenti separati. La capacità riparativa viene valutata mediante comet test trattando i linfociti con H 2 O 2 (0-100-200 µM) per 5 min.; quindi le cellule vengono mantenute a 37° C per 20 e 60 min per favorire la riparazione. Il contenuto di GSH totale nei linfociti di ciascun soggetto è stato determinato mediante test colorimetrico (Calbiochem, Gluthatione Assay Kit). Risultati I risultati ottenuti indicano che i fumatori presentano di base parametri di danno significativamente superiori ai controlli e che TM, TI e numero di comete sono positivamente e significativamente correlati con il numero di sigarette/die. I soggetti esposti a fumo passivo mostrano livelli dosabili di nicotina e cotinina nelle urine. Il danno cellulare (TM, TI e numero di comete) è presente anche nei soggetti esposti a fumo passivo, sia exche non-fumatori. Gli ex-fumatori esposti a fumo passivo mostrano una correlazione inversa statisticamente significativa tra numero di comete e anni di astinenza dal fumo. Il contenuto cellulare di GSH non differisce medialmente nei diversi gruppi, ma solo nei fumatori il GSH linfocitario è inversamente e significativamente correlato con TM e TL. La capacità di riparare i danni indotti da diverse dosi di H 2 O 2 è stata valutata mediante una cinetica riparativa (T0, T20 e T60 min). I risultati indicano che i controlli riparano il danno indotto dall’H 2 O 2 a 100 µM in breve tempo (T20 min) e dopo 60 min a 200 µM. I linfociti provenienti dai fumatori attivi e passivi (ex- e non-fumatori) risultano gravemente danneggiati da ambedue le dosi di H 2 O 2 : i danni non vengono riparati neanche dopo 60 min. Discussione Numerosi e noti sono i dati della letteratura che indicano che i linfociti di soggetti fumatori presentano danni al DNA misurabili mediante diversi test genetici (SCE, CA, micronuclei, comet test). I risultati di questo studio confermano gli effetti genotossici del fumo, e dimostrano che i parametri di danno cellulare sono correlati con il numero di sigarette fumate e con la presenza di nicotina nelle urine, mentre sono inversamente correlati con il contenuto di GSH, molecola attiva nei processi molecolari di detossificazione. È da notare che un soggetto dichiaratosi non fumatore, che presentava bassi livelli di nicotina e cotinina nelle urine, ma con parametri di danno cellulare al comet test paragonabili ad un fumatore, ad una successiva intervista affermava di aver smesso di fumare da cinque giorni. Tale dato fornisce un’ulteriore conferma che il comet test è particolarmente sensibile nel rilevare i danni indotti dal fumo di sigaretta. Recentemente si è dimostrato che anche l’inalazione passiva di fumo di sigaretta costituisce un fattore di rischio per neoplasie polmonari. Meno noti sono i dati che indicano che esposizioni a fumo passivo, di soggetti che non hanno mai fumato o che sono degli ex-fumatori, possono indurre danni al DNA dei linfociti. I dati ottenuti evidenziano che i non-fumatori esposti presentano un danno basale medialmente superiore del 30% rispetto ai controlli, mentre negli ex-fumatori il danno raggiunge circa il 48%. Interessante è il dato emerso nel gruppo degli ex-fumatori esposti, questi presentano una minor percentuale di cellule con cometa aumentando il tempo trascorso dalla sospensione dal fumo. Drammatico è il risultato ottenuto riguardo l’efficienza riparativa dei linfociti provenienti dai fumatori attivi e dai non- ed ex-fumatori esposti: i tre gruppi non riescono a riparare i danni indotti dall’H 2 O 2 , e i dati indicano che i soggetti che presentano il danno più consistente sono gli esposti non-fumatori. Ringraziamenti Parzialmente supportato da 2003063319-005 MIUR-COFIN 2003. Bibliografia 1) Vineis P., Caporaso N., Tobacco and cancer: epidemiology and the laboratory. Environ. Health Perspect. 1995; 103: 156-160. 2) Haufroid V., Lison D., Urinary cotinine as a tobacco-smoke exposure index: a minireview. Int. Arch. Occup. Environ. Health 1998; 71: 162-168. 3) Rahn C.A., Howard G., Riccio E., Doolittle D.J., Correlations between urinary nicotine or cotinine and urinary mutagenicity in smokers on controlled diets. Environ. Mol. Mutagen 1991; 17(4): 244-252. 4) Singh N.P., Tice R.R., Stephens R.E., Schneider E.L., A microgel electrophoresis technique for the direct quantitation of DNA damage and repair in individual fibtroblasts cultured on microscope slides. Mutat. Res 1991; 252: 289-296. 5) Schmezer P., Rajaee-Behbahani N., Risch A, Thiel S., Bartsch H., Rapid screening assay for mutagen sensitivity and DNA repair capacity in human blood lymphocytes. Mutagenesis 2001; 16: 25-30.
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