Comunicazioni orali e Poster sul Monitoraggio biologico - Giornale ...

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
www.gimle.fsm.it 103
E. Scotti 1 , G. De Palma 1,2 , P. Mozzoni 1,2 , S. Carnevali 3 , F. Luppi 3 , A. Caglieri 2 , M.V. Vettori 1,2 , M. Goldoni 1,2 , L. Fabbri 3 , A. Mutti 2
Caratterizzazione in vitro dell’espressione dell’eme ossigenasi 1
in cellule epiteliali polmonari umane esposte a fumo di sigaretta
1 Centro Studi e Ricerche ISPESL, Università degli Studi di Parma
2 Laboratorio di Tossicologia Industriale, Università degli Studi di Parma
3 Clinica di Malattie dell’Apparato Respiratorio, Università di Modena e Reggio Emilia
RIASSUNTO. Viene presentato uno studio in vitro su linee epiteliali
e fibroblastiche polmonari esposte a concentrazioni crescenti (5 e 10%)
di estratto di fumo di sigaretta (EFS) e a N-acetilcisteina (NAC). L’espressione
genica dell’eme ossigenasi 1 (HO-1) era stimolata dall’EFS in
maniera dose-dipendente nelle cellule epiteliali bronchiali immortalizzate
(linea BEAS 2B) e fibroblastiche polmonari fetali (linea HFL1), ma
non nelle epiteliali da adenocarcinoma polmonare (linea A549). L’espressione
di HO-1, regolata in maniera differente nelle tre linee cellulari,
sembra stimolata dallo stress ossidativo indotto da EFS.
Parole chiave: eme ossigenasi 1, espressione genica, estratto di fumo
di sigaretta, modelli in vitro, cellule epiteliali e fibroblastiche polmonari.
ABSTRACT. IN VITRO CHARACTERIZATION OF HEME OXYGENASE 1
IN HUMAN EPITHELIAL LUNG CELLS EXPOSED TO CIGARETTE SMOKE. We
present an in vitro study of lung epithelial and fibroblastic cell lines exposed
to growing concentrations (5%, 10%) of cigarette smoke extract
(CSE), and to N-acetylcysteine. The heme oxygenase 1 (HO-1) gene expression
was stimulated by CSE in a dose-dependent manner in both immortalized
bronchial epithelium (BEAS 2B) and foetal pulmonary fibroblasts
(HFL1), whereas no effect was seen in lung adenocarcinoma cells
(A549). HO-1 gene expression, differently regulated in the three cell lines,
seems to be provoked by CSE induced oxidative stress.
Key words: heme oxygenase 1, gene expression, cigarette smoke extract,
in vitro model, lung epithelial and fibroblastic cells.
Introduzione
L’eme ossigenasi (HO), enzima ubiquitariamente espresso,
catalizza l’ossidazione dell’eme a biliverdina, con rilascio di ferro
(Fe 2+ ) e monossido di carbonio (CO). Sono note tre isoforme,
codificate da geni specifici: HO-1 inducibile, HO-2 costitutiva ed
HO-3 espressa costitutivamente ma a bassa attività metabolica.
L’espressione di HO-1, oltre che dal substrato fisiologico, è indotta
da una varietà di stimoli associati con stress ossidativo e infiammazione.
I prodotti di reazione hanno funzioni antiossidanti
e antinfiammatorie (1). La biliverdina è biotrasformata dalla biliverdina
reduttasi a bilirubina, potente antiossidante endogeno. Il
CO media un effetto miorilassante sulla muscolatura liscia ed effetti
citoprotettivi ed anti-apoptotici. Il fumo di sigaretta è una
miscela complessa in grado di determinare stress ossidativo ed
infiammazione a livello dell’epitelio polmonare. Cellule in coltura
esposte a fumo di sigaretta presentano effetti tipici dello stress
ossidativo, come perossidazione lipidica, rotture a singolo filamento
del DNA e decremento dei livelli intracellulari di glutatione
(2-4).
Materiali e metodi
L’esperimento è stato condotto su linee cellulari umane, derivate
rispettivamente da cellule epiteliali bronchiali immortalizzate
(BEAS 2B), cellule epiteliali alveolari da adenocarcinoma polmonare
(A549) e fibroblasti polmonari fetali (HFL1). Le cellule
sono state esposte a concentrazioni crescenti (5 e 10%) di estratto
di fumo di sigaretta (EFS), ottenuto facendo gorgogliare il fumo
di sigaretta in una beuta contenente 25 ml di terreno di coltura.
Dopo filtrazione e diluizione alla concentrazione desiderata, le
cellule sono state trattate con EFS entro 30 minuti dalla sua preparazione.
È stata prevista anche la co-somministrazione di Nacetilcisteina
(NAC), in associazione ad EFS 10%. L’RNA totale
è stato estratto da circa 5 x 10 6 cellule con metodica Trizol, digerito
con Dnasi I, quantificato con sonda RiboGreen e valutato tramite
elettroforesi su gel d’agarosio 1% in 1X TBE. L’RNA totale
(1 µg) è stato retrotrascritto a cDNA utilizzando Random Decamers
(2.5 µM) e SuperScript II (200 U) RT con protocollo standard,
in 20 µl. Un’aliquota di cDNA è stata diluita 1:8 in H 2 O per
la reazione di PCR quantitativa in tempo reale su iCycler (Bio-
Rad) con chimica SYBR Green I. I primers per il gene HO-1 sono
stati disegnati con software Primer3 su sequenza NM 002133
(GenBank), mentre per l’amplificazione dei geni di controllo β2microglobulina,
succinato de-idrogenasi subunità A ed ipoxantina
fosforibosil-trasferasi 1 sono stati utilizzati primers pubblicati (5).
Le reazioni di PCR (25 µl), contenenti 1 µl di cDNA, 12.5 µl di
2X iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) e 300 nM di ciascun primer,
sono state eseguite in duplicato per ciascun campione secondo
il protocollo: 3’ a 95 °C, seguiti da 40 cicli di 30s a 95 °C, 30s
a 61 °C e 30s a 72 °C, quindi 1’ a 95 °C e denaturazione (melting)
finale, con incremento graduale della temperatura da 50 °C a 94
°C. Il livello di espressione dell’HO-1, mediato su 3 esperimenti
separati, viene ottenuto dopo normalizzazione rispetto all’espressione
dei 3 geni di controllo, tramite algoritmo geNorm (5). L’espressione
genica è stata valutata dopo 24h dallo stimolo per i tre
tipi cellulari e dopo 3h per le sole BEAS 2B.
Risultati
Nelle BEAS 2B l’espressione di HO-1 è aumentata, rispetto al
controllo non trattato, già 3h dopo l’esposizione, con un andamento
dose-dipendente (mediamente di 110,61 vv. per EFS=5%, e
di 277,59 vv. per EFS=10%). Nelle BEAS 2B e HFL1, a 24h dallo
stimolo, i livelli di HO-1 sono aumentati per EFS= 5% (rispettivamente
di 20,88 e 27,5 vv. in BEAS 2B ed HFL1). In entrambi
i casi l’incremento è dose-dipendente e più evidente nelle HFL1
(incremento vs. controllo di 35,9 e 270,65 vv. per EFS=10% in
BEAS 2B e HFL1, rispettivamente). La co-somministrazione di
NAC riduce l’espressione genica in entrambe le linee (riduzione,
rispetto al trattamento con EFS 10%, del 91% e del 96% in BEAS
2B ed HFL1, rispettivamente). Nelle A549 i livelli di espressione
genica osservati a 24h dall’esposizione sono molto modesti (incremento
medio di 1,86 volte rispetto al controllo per il campione
trattato con EFS 10%), e la co-somministrazione di NAC ed EFS
al 10% non modifica significativamente i livelli di espressione.
Discussione
I risultati ottenuti, da considerarsi come preliminari in quanto
gli esperimenti sono in fase di completamento, sembrano promettenti.
Le diverse risposte osservate nelle linee epiteliali
(BEAS 2B ed A549) sembrano correlate al diverso fenotipo cel-