Comunicazioni orali e Poster sul Monitoraggio biologico - Giornale ...

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO
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PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Ad ogni aliquota di siero (0.3 ml) vengono aggiunti 0.3 ml di
tampone acetato (2M, pH 5.2), 10 µl di fenacetina (1 mg/ml) quale
standard interno (IS) (5) e 12 µl di β-glucuronidasi (110.2
unità/ml), lasciando quindi idrolizzare il campione per una notte
a 37° C (tale ultima procedura risulta superflua nella messa a
punto del metodo, per la quale viene utilizzato siero drug free al
quale vengono aggiunte quantità note di CHZ e 6-OH-CHZ). Al
siero così trattato si aggiungono 2 ml di acido perclorico 0.6 M
allo scopo di far precipitare le proteine. Dopo aver centrifugato
per 5 minuti a 10.000 RPM, i due analiti vengono estratti dal surnatante
con 10 ml di ter-butil metil etere in due estrazioni successive
per la durata di 10 minuti ciascuna. Il ter-butil metil etere
viene quindi tirato a secco a 40°C in centrifuga UNIVAPO 100
(durata circa 15 minuti), e il residuo ripreso con 200 µl di fase
mobile (acido acetico 0.5%/acetonitrile, 70/30 vv) ed analizzato
in HPLC con rivelatore UV.
CONDIZIONI LC-UV
Le condizioni analitiche per il metodo HPLC sono le seguenti:
– pre colonna Beckman ODS 4.6 mm (diametro interno) x 4.5
cm (lunghezza)
– colonna C18 Beckman ODS 5 µm ∅, 4.6 mm, 25 cm
– fase mobile: acido acetico 0.5%/acetonitrile (70/30 vv)
– flusso: 1 ml/minuto
Figura 1. Rese percentuali di estrazione di 6-OH-CHZ e CHZ con diversi solventi organici
– λ detector: 287 nm
– volume iniettato: 20 µl.
I tempi di ritenzione di 6-OH-CHZ, IS, e CHZ sono rispettivamente
di 5, 9 e 14 minuti.
Risultati e Discussione
La presente metodica è stata messa a punto partendo da quella,
già validata, descritta da Lucas et al.(1993) (6). La fase di estrazione
liquido-liquido è stata mantenuta immodificata, tuttavia si e`
sostituito l’etilacetato con il ter-butil metil etere, solvente che, oltre
a garantire un recupero paragonabile se non superiore a quello
dell’etilacetato, è estremamente volatile e pertanto riduce notevolmente
i tempi di estrazione. L’estratto così ottenuto risulta poi molto
pulito e non presenta emulsioni inquinanti che possono dare interferenze
nella determinazione del 6-OH-CHZ o del CHZ che
comprometterebbero l’efficienza della colonna e di tutto il sistema
cromatografico. In figura 1 sono riportate le tipiche rese di estrazione
ottenute utilizzando diversi solventi organici.
Un’ulteriore modifica da noi apportata è stata l’introduzione di
uno standard interno (5), la fenacetina, per ovviare agli inevitabili
errori dovuti ad estrazione parziale, recupero incompleto del solvente
di estrazione, agitazione disomogenea del campione, ecc.,
tutti fattori che possono inficiare la determinazione quantitativa dei
due analiti. A tale proposito possiamo vedere nella Figura 2 come
l’introduzione dello standard interno migliori notevolmente la linearità
della retta di calibrazione.
A B
Figura 2. Rette di calibrazione di 6-OH-CHZ e CHZ, con e senza standard interno. Le rette ottenute dal rapporto delle aree
di ciascuno dei due analiti con quella dello standard interno risultano maggiormente lineari (A, r 2 = 0.9994 per il 6-OH-CHZ
e = 0.9996 per il CHZ) di quelle ottenute tabulando direttamente le aree di 6-OH-CHZ e CHZ (B, r 2 = 0.9951 per il 6-OH-CHZ
e di 0.9949 per il CHZ)