Comunicazioni orali e Poster sul Monitoraggio biologico - Giornale ...

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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO www.gimle.fsm.it 21 centrazioni ematiche, il SF ha dimostrato tossicità epatica, depressione respiratoria e cardiovascolare, convulsioni ed ipertermia maligna (4). Il SF reagisce con la Soda Lime [NaOH 5%, Ca(OH)2 95%], utilizzata per assorbire la CO 2 nei circuiti di anestesia, producendo il Composto A, riconosciuto nefrotossico nei ratti. Nell’uomo sono state segnalate lesioni reversibili del tubulo renale, anche a basse concentrazioni (5,7). Per il monitoraggio biologico dei soggetti professionalmente esposti sono spesso utilizzati i fluoruri nelle urine, che presentano bassa specificità. Più recentemente è stato proposto il dosaggio urinario dell’alcool esa-fluoro-isopropilico e del sevoflurano tal quale (2,5,8). Con il presente contributo si riportano i risultati preliminari delle associazioni tra i valori medi delle concentrazioni di SF e PA nei campioni urinari di 65 soggetti professionalmente esposti a basse concentrazioni ed i valori medi ambientali degli stessi anestetici riscontrati in 12 sale operatorie, rilevati nel 2004 in un ospedale lombardo. Materiali e metodi Determinazioni ambientali: I monitoraggi ambientali sono stati eseguiti in 12 sale operatorie nei mesi di febbraio-marzo 2004, tramite monitor Brüel-Kjaer per analisi dei gas, dotato di spettroscopia fotoacustica a raggi infrarossi, come sistema analitico, e di microfono come trasduttore di misura. Per la presente analisi sono stati utilizzati i rilievi medi relativi all’intera seduta operatoria (1). Il campionamento è avvenuto posizionando il sensore a circa 150 cm di altezza, in prossimità del campo operatorio. Raccolta e conservazione dei campioni urinari: I campioni di urine sono stati raccolti al termine della seduta operatoria o dopo almeno tre ore dall’inizio dell’intervento. La raccolta dei campioni urinari è stata condotta al di fuori del comparto operatorio, nel minor tempo possibile (entro 5 minuti), utilizzando contenitori con 0.2 ml di acido solforico 9N, immediatamente sigillati. I campioni raccolti sono stati conservati a 4°C ed analizzati entro una settimana. Le determinazioni di SF e PA sono state effettuate in gas-cromatografia con la tecnica dello spazio di testa e rilevazione ECD, secondo il metodo proposto da Buratti et al. (2), parzialmente modificato. Si è utilizzato un gas-cromatografo Perkin Elmer 8500 dotato di rivelatore a cattura di elettroni. Come gas di trasporto (carrier) e di make-up è stato utilizzato azoto puro. La linearità delle determinazioni è stata valutata tramite sequenze scalari di standard (Sevorane - Abbott) da 10 a 1000 µg/L. Il limite di rilevabilità per il SF è di 1,0 µg/L. I dosaggi sono stati effettuati presso il Laboratorio di Tossicologia della UO di Medicina del Lavoro e Preventiva dell’Ospedale di Circolo di Varese. Risultati In Tabella I sono riportati i valori medi ambientali del SF e del PA, per le singole sale operatorie sottoposte a controllo, il numero di campioni di urine raccolte ed i valori medi urinari (e relativo errore standard) dei dosaggi di SF e PA. Un soggetto con riconosciuta infezione delle basse vie urinarie e con campioni raccolti in due sale operatore è stato escluso per il dosaggio di PA. Tabella I. Valori ambientali e biologici di protossido di azoto e sevoflurano registrati La variabilità statistica spiegata (R 2 ) dei rilievi biologici è risultata superiore per il sevoflurano rispetto al protossido di azoto. Il coefficiente di correlazione lineare di Pearson è risultato di 0,47 per il PA e di 0,63 per il SF. Discussione I vantaggi della determinazione del SF tal quale sono rappresentati dalla elevata specificità, dalla possibilità di poterlo determinare con la medesima colonna del PA. Per contro lo svantaggio principale è rappresentato dalla necessità di avere elevate sensibilità dello strumento di rilevazione (2, 3). L’ampiezza degli intervalli di confidenza riscontrati indica la considerevole variabilità dei dosaggi biologici, che possono risentire di numerosi fattori, quali i tempi e le modalità di stazionamento in sala operatoria, oltre che delle variabilità intra-individuale e analitica. Una ulteriore standardizzazione delle variabili individuali e della tecnica analitica, potrebbero migliorare ulteriormente le associazioni con i livelli ambientali, incluso l’utilizzo di campionatori personali. Bibliografia 1) Accorsi A, Barbieri A, Raffi GB, Violante FS. Biomonitoring of exposure to nitrous oxide, sevoflurane, isoflurane and halothane by automated GC/MS headspace urinalysis. Int Arch Occup Environ Health 2001; 74: 541-548. 2) Buratti M, Pellegrino O, Valla C, Colombi A. Monitoraggio biologico dell’esposizione professionale a gas e vapori anestetici: determinazione di protossido d’azoto, alotano e isofluorano nell’urina. Med Lav 1993; 84: 66-73. 3) Cassano F, De Marinis G, Bavaro P, Dentamaro A, Basso A, Giacomantonio A, Rubino G, Ricci G, Aloise I, Minenna MT. Esposizione professionale ad anestetici inalatori: 10 anni di misure in ospedali pugliesi. G Ital Med Lav Erg 2003; 25(3 Suppl.): 279. 4) Desogus GF. Esposizione occupazionale ad anestetici volatili e neurotossicità. G Ital Med Lav Erg 2003; 25(3 Suppl.): 412. 5) Imbriani M, Zadra P, Negri S, Alessio A, Maestri L, Ghittori S. Monitoraggio biologico dell’esposizione professionale a sevoflurane. G Ital Med Lav Erg 2003; 25: 137-141. 6) Cottica D, Bartolucci GB, Grignani E, Locatelli C, Sala C, Scapellato ML, Sesana G. Gas anestetici. Minoia C, Perbellini L., (Eds.) Monitoraggio ambientale e biologico dell’esposizione professionale a xenobiotici. Volume 4. Morgan Edizioni Tecniche, Milano, 2001, pp. 32-36. 7) Proietti L. Anestesia a bassi flussi ed inquinamento ambientale. G Ital Med Lav Erg 2001; 23: 14 -17. 8) Virgili A, Scapellato ML, Maccà I, Perini M, Carrieri M, Gori G, Saia B, Bartolucci GB. Esposizione professionale a gas anestetici in alcuni ospedali del Veneto. G Ital Med Lav Erg 2002; 24: 447-450.
COMUNICAZIONI ORALI E POSTER SUL MONITORAGGIO BIOLOGICO G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, Suppl 22 www.gimle.fsm.it A. Baccarelli 1,2 , A. Pesatori 1 , D. Consonni 3 , D.Patterson Jr. 4 , M. Bonzini 1 , B. Marinelli 1 , J. A. Grassman 5 ,P.A. Bertazzi 1 , M.T. Landi 2 Metodologie molecolari e genetiche nello studio degli effetti di agenti occupazionali ed ambientali: l’esempio del “Seveso Molecular Epidemiology Project” 1 Dipartimento di Medicina del Lavoro “Clinica L. Devoto”, Università degli Studi di Milano, Milano 2 Genetic Epidemiology Branch, Division of Cancer Epidemiology and Genetics, National Cancer Institute, NIH, DHHS, Bethesda, MD, USA 3 Unità Operativa di Epidemiologia, Azienda Ospedaliera Istituti Clinici di Perfezionamento, Milano 4 Division of Environmental Health Laboratory Science, National Center for Environmental Health, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA 5 Health and Nutrition Sciences, Brooklyn College, CUNY, Brooklyn, NY, USA RIASSUNTO. Nel 1997 la IARC ha classificato la 2,3,7,8tetraclorodibenzo-p-diossina (TCDD) come un cancerogeno per l’uomo sulla base di sufficienti evidenze da esperimenti animali e limitate evidenze da studi epidemiologici. Un ruolo chiave fu attribuito alla presenza di un meccanismo di azione ben definito che richiede l’attivazione del recettore Aryl-hydrocarbon (AhR). Studi sperimentali negli animali ed in vitro indicano che i livelli cellulari di AhR diminuiscono in seguito al legame recettoriale della TCDD. Approssimativamente 20 anni dopo l’incidente di Seveso, abbiamo osservato livelli diminuiti di trascrizione di AhR nei soggetti esposti che erano correlate ai livelli di TCDD plasmatica. Questi risultati suggeriscono la presenza di un fenomeno di down-regulation di AhR, comparabile a quello osservabile in molti altri sistemi recettoriali. Questi risultati dimostrano per la prima volta che i meccanismi di regolazione indotti da TCDD nel sistema AhR osservati precedentemente in studi sperimentali si verificano in maniera simile anche nei soggetti esposti. I nostri dati sono fondamentali per estrapolare all’uomo gli effetti conseguenti alla attivazione del sistema AhR osservati in modelli sperimentali. Parole chiave: 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina (TCDD), recettore Aryl-hydrocarbon, esposizione ambientale. ABSTRACT. MOLECULAR AND GENETIC METHODS FOR STUDYING THE EFFECTS OF OCCUPATIONAL AND ENVIRONMENTAL AGENTS: THE SE- VESO MOLECULAR EPIDEMIOLOGY PROJECT. In 1997, IARC classified 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) as carcinogenic to humans, based on sufficient evidence from animal data and limited evidence from human data. A key role in the IARC classification was played by the welldefined mechanism of TCDD action involving the activation of the Arylhydrocarbon Receptor (AhR). Experimental animal and in-vitro studies indicate that AhR levels decrease following TCDD binding. Nearly 20 years after the Seveso accident, we found a decrease in AhR mRNA levels in TCDD-exposed subjects. AhR transcript levels were correlated with plasma TCDD concentrations. Our results may reflect a down-regulation of AhR, similar to that observed in most receptorial systems. We demonstrated, for the first time in humans, that TCDD-related regulation of the AhR pathway, previously observed in experimental studies, may also occur in exposed subjects. Our data are important for extrapolating AhR-mediated effects from experimental models to humans. Key words: 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), Aryl-hydrocarbon Receptor, environmental exposure. Introduzione Nel 1997 la IARC ha classificato la 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina (TCDD) come un cancerogeno di classe 1 (cancerogeno per l’uomo) sulla base di sufficienti evidenze da esperimenti animali e limitate evidenze da studi epidemiologici. Un ruolo chiave fu attribuito dalla commissione alla presenza di un meccanismo di azione ben definito che richiede l’attivazione del recettore Aryl-hydrocarbon (AhR) per mediare gli effetti tossici della TCDD. I componenti molecolari del sistema AhR sono simili negli animali e nell’uomo. AhR è un recettore nucleare che, in presenza di TCDD, forma un eterodimero attivo con il cofattore ARNR ed induce la trascrizione di enzimi, quali il citocromo P4501A1 (CYP1A1) e P4501B1 (CYP1B1) coinvolti nel metabolismo di xenobiotici. La espressione prolungata di questi enzimi può provocare un aumento di lesioni del DNA a causa della generazione di metaboliti genotossici e di radicali reattivi dell’ossigeno. Gli effetti sul sistema AhR della esposizione a diossine non è mai stata studiata nell’uomo in vivo. Abbiamo disegnato e condotto uno studio molecolare per indagare lo stato di attivazione del sistema AhR su un campione di soggetti rappresentativo della popolazione esposta a TCDD in seguito all’incidente di Seveso e di una popolazione di controllo non esposta. Abbiamo campionato casualmente 62 soggetti della popolazione delle zone altamente contaminate (A+B) e 59 dalla zona circostante non contaminata (non-ABR) (1). Nei soggetti di zona A e B, i livelli di TCDD plasmatici erano ancora elevati con concentrazioni che arrivavano fino a 90 ppt (2). Materiali e metodi I soggetti dello studio sono stati reclutati tra il dicembre 1992 ed il marzo 1994. I livelli di mRNA dei geni AhR, ARNT, CYP1A1 e CYP1B1 e della attività EROD CYP1A1-dipendente sono stati misurati in linfociti periferici (3, 4). Alcuni dei marcatori del sistema AhR, come l’espressione di CYP1A1 e l’attività EROD, sono presenti solo a livelli estremamente bassi in linfociti non coltivati. Abbiamo quindi utilizzato, in aggiunta a linfociti non coltivati, linfociti coltivati con mitogeno o con mitogeno + 10 nM TCDD. I livelli di mRNA di AhR, ARNT, CYP1A1, and CYP1B1 sono stati misurati tramite quantitative competitive reverse transcription PCR (RT-PCR). Risultati Livelli dei markers del sistema AhR nelle differenti condizioni cellulari: Nelle cellule non coltivate, abbiamo analizzato soltanto AhR, ARNT e CYP1B1. I livelli medi di mRNA erano 1.19 x 10 6 copie per AhR, 0.47 x 10 6 copie per ARNT e 0.11 x 10 6 copie per CYP1B1. L’espressione di ARNT non è stata misurata in cellule coltivate perché la quantità di cellule disponibili era limitata. Tutti gli altri markers, che includevano AhR, CYP1A1, CYP1B1 e EROD, sono stati potentemente indotti quando le cellule sono state coltivate con mitogeno o con mitogeno + TCDD. TCDD plasmatica e il sistema AhR: Nei soggetti con più alta esposizione a TCDD, i livelli di mRNA di AhR (in tutte le condizioni cellulari utilizzate) e di ARNT tendevano ad essere più bassi. Abbiamo utilizzato tecniche di analisi statistica multivariata per correggere i risultati per la presenza di fattori indivi-
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