Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...

PROJEKTE UND ERGEBNISSE
3 Sucroseporin, Abbildung am SFM
Abbildung 28: (vorherige Seite) Höhenbestimmung adsorbierter Vesikelfragmente mit rekonstituiertem
ScrY: A: Bidirektional rekonstituiertes ScrY, Histogramm der Höhenwerte (innerhalb des eingezeichneten
Rahmens) von Vesikelfragment und Substrat (LP R = 0, 2, Lipid: DMPC/POPC (9:1), Messpuffer:
250 mM LiCl, 2 mM MgCl 2 , 20 mM Tris/HCl pH 7,6). B: Verteilung der Höhenwerte auf bidirektional
rekonstituiertem ScrY, dasselbe Präparat wie A. C: Unidirektional rekonstituiertes Porin, Histogramm der
Höhenwerte von Vesikelfragment und Substrat (LP R = 0, 15; Lipid: DMPC/POPC (1:1); Mg-haltiger Adsorptionspuffer,
Messpuffer: 250 mM LiCl, 10 mM MES pH 6). Für C erhält man bei Messsung in pH 7,7
leicht (0,1 bis 0,2 nm) höhere Werte, also im Bereich des aus dem Histogramm abschätzbaren Fehlers.
entsprechend aneinanderlegt (Abb. 29). Bei kompletter Deformation aller Loops hätte man immer
noch eine Höhendifferenz (β-Barrel extrazellulär - β-Barrel periplasmatisch) von ca. 0,75 nm.
Dies setzt jeweils voraus, dass die Sensorspitze den starren Kernbereich der periplasmatischen
Seite erreicht und nicht von dem als sehr flexibel anzunehmenden N-Terminus daran gehindert
wird. Auch die gemessene Höhe der Vesikelmembranen passt gut mit diesem Modell zusammen:
Abbildung 29: Modell bidirektionaler Rekonstitution von ScrY anhand der Röntgenstruktur des Trimers.
Hier wurden die membrandurchspannenden hydrophoben Oberflächen beider Moleküle aneinandergelegt.
Aromatische Reste grün; hydrophobe Zone (etwa 3 nm hoch) blau hinterlegt; p: periplasmatische, e: extrazelluläre
Seite. (Quelle: Wolfram Welte, verändert).
das Barrel ist etwa 5 nm hoch, Werte dieser Größenordnung (etwas höher durch externe Loops)
erhält man in den niedrigeren (im Modell mit periplasmatischer Seite nach oben exponierten) Bereichen.
Die umgekehrt in der Membran orientierten Trimere liegen dagegen gut einen nm höher
über dem Substrat, im Modell ist die extrazelluläre Seite exponiert. Bei unidirektionalem Einbau
misst man typischerweise ebenfalls Werte von deutlich über 6 nm, was ebenfalls nahelegt, dass die
extrazelluläre Seite nach oben orientiert ist; hier muss nämlich noch der zwischen dem Substrat
und dem gut 5 nm hohen Trimer unterzubringende N-Terminus berücksichtigt werden. Dass bidirektionaler
Einbau zu größeren Vesikeln führt ist unmittelbar verständlich, wenn man bedenkt,
dass bei unidirektionalem Einbau eventuell mit einer durch die Geometrie des Proteins bedingten
Krümmung des Bilayers zu rechnen ist.
Eine andere Möglichkeit der Charakterisierung von unterschiedlich orientiertem rekonstituiertem
ScrY besteht in der Aufnahme von Kraftdistanzkurven. Im eher seltenen Fall eines flach kollabier-
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