Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...

PROJEKTE UND ERGEBNISSE
3 Sucroseporin, Rekonstitution
Die Stabilität der N-terminalen Tertiärstruktur (Coiled-Coil) hingegen ist, verglichen mit dem
Barrel-Trimer, deutlich geringer, diese denaturiert bereits bei 44 ◦ C (Dumas et al., 2000). Die
maximale Temperatur von 37 ◦ C bei der Rekonstitution lag allerdings noch deutlich darunter.
Unter den Bedingungen für die Rekonstitution wurden im Dialysepuffer die Konzentration der
zweiwertigen Ionen ([MgCl 2 ] zwischen 2 und 80 mM) sowie der pH (zwischen 6 und 8) variiert.
Beste Ergebnisse ergaben sich bei einem pH 6 und hoher [MgCl 2 ] von 50 bis 80 mM. Zweimaliges
Durchlaufen der Temperaturstufen 20 ◦ C → 37 ◦ C → 20 ◦ C und damit zweimaliges Durchschreiten
der Phasenumwandlung des Lipids von flüssig nach quasikristallin (Jap et al., 1992) während
der 72-stündigen Rekonstitution erbrachte gegenüber einem entsprechenden einphasigen Temperaturprofil
keine Vorteile. Ein signifikanter Unterschied bei den Ergebnissen der Dialyse in der
optimierten Durchflussapparatur gegenüber den in einem möglichst kleinen Flüssigkeitsvolumen
(mit gleicher Pufferaustauschrate) eingetauchten Dialyse-Buttons war nicht festzustellen.
Unter diesen Bedingungen ergibt sich bei Variation des Massenverhältnisses Lipid zu Protein
(LPR) ein deutlicher Übergang von großen Vesikeln mit einem Durchmesser von mehreren µm
bei LPR = 0,1 zu kleineren Vesikeln (wenige 100 nm bis 1 µm Durchmesser) bei LPR > 0,15
(Abb. 25). Über einem LPR von 0,3 sieht man alle Zeichen von Lipidüberschuss, nämlich kleine
Lipidvesikel, mehrschalige Vesikel („Onion-Struktur“, Lorenz Hasler, pers. Mitt.) sowie „milchiges“
Erscheinungsbild derselben im Elektronenmikroskop. Bei höherem LPR ist außerdem die
mechanische Stabilität der Präparationen bei SFM-Messungen deutlich geringer. Wie gezeigt wurde
(s. unten), handelt es sich bei den großen Vesikeln um amorph und bidirektional rekonstituiertes
Sucroseporin, bei den kleineren finden sich unidirektional-kristallin rekonstituierte Anteile. Näheres
zum Einbau des Proteins bei den beiden Typen von Vesikeln siehe unter 3.3.2. Bei kleinem
LPR beginnen offenbar Protein-Protein-Wechselwirkungen die Interaktionen des Proteins mit dem
Lipid zu überwiegen. Auch die Fluidität des Lipids spielt hier eine Rolle, mischt man bei einem
Gesamt-LPR von 0,15 - 0,2 das Lipid DMPC zu gleichen Teilen mit dem fluideren POPC, so erhält
man einen vergleichsweise hohen Anteil unidirektional mit ScrY gepackter und teils kristalliner
Vesikelfragmente (kristalline Areale mit bis zu ca. 400-500 nm maximaler Ausdehnung, in Ausnahmefällen
bis 700 nm). Bei geringerem POPC-Anteil (10 - 20% der Lipidmasse) erhält man auch
bei diesem LPR noch einen höheren Anteil amorph-bidirektionalen Einbaus und manchmal auch
einen höheren Anteil größerer Vesikel. Bei verschwindendem Lipidanteil kommt es zu schwer
definierbaren Proteinaggregaten und nur sehr wenigen kleinen Vesikeln durch Restlipid von der
Proteinreinigung. Rekonstituiertes ScrY lag praktisch durchgehend in Form gewöhnlicher Vesikel
vor, röhrenförmige Vesikel oder mehrschichtige Stapel waren nicht zu beobachten. Lediglich
in den Fraktionen mit besonders großen Vesikeln waren (teils doppellagige) Fragmente enthalten,
deren vesikulärer Ursprung auch im Elektronenmikroskop nicht immer eindeutig nachgewiesen
werden konnte (wahrscheinlich aber kollabierte große Vesikel).
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