Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...
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PROJEKTE UND ERGEBNISSE<br />
3 Sucroseporin, Diskussion<br />
N-Terminus zuzuschreiben. Hier können erst gute Kristalle zuverlässigere Information bringen.<br />
Die Zugänglichkeit der periplasmatischen Seite war im Lauf dieser <strong>Untersuchungen</strong> noch ein Problem,<br />
da bei unidirektional gepackten Vesikeln die extrazelluläre Seite bevorzugt innen und damit<br />
bei einlagiger Adsorption oben lag. Mech<strong>an</strong>isch stabile zweilagig adsorbierte Vesikelfragmente<br />
bzw. stabile zweischichtige Kristalle wie bei OmpF (Schabert und Engel, 1994) waren unter dem<br />
SFM bei rekonstituiertem ScrY aber nicht zu beobachten. Möglicherweise bilden die extrazellulären<br />
Loops von ScrY keine entsprechenden Wechselwirkungen mitein<strong>an</strong>der (Schabert et al., 1995).<br />
Bei amorph-bidirektionalen Fragmenten sind beide Seiten zwar gleichermaßen zugänglich, aber<br />
eben nicht in kristalliner Form, zudem ist hier wegen geringeren Kontrasts der periplasmatisch<br />
orientierten Trimere eine gezielte Partikelselektion für referenzfreies Alignment schwierig.<br />
Größere Bilayer mit rekonstituiertem Protein gleichmäßiger Qualität erleichtern die praktische<br />
Optimierung der Abbildungsbedingungen, insbesondere der Auflagekraft, während der Messung<br />
bzw. dem schrittweisen Überg<strong>an</strong>g von der Übersichtsabbildung zur hochaufgelösten Messung.<br />
Dieser Prozess k<strong>an</strong>n nämlich nicht gänzlich zerstörungsfrei erfolgen, so dass die Möglichkeit, auf<br />
unmittelbar benachbarte brauchbare Areale ausweichen zu können, von großem Vorteil ist. Eine<br />
unidirektionale Packung über größere Bereiche ermöglicht auch die Optimierung der Pufferbedingungen<br />
für die jeweilige Seite, der bisher verwendete Messpuffer schuf lediglich Kompromissbedingungen<br />
für die Abbildung beider Seiten. Die gemessenen Kraftdist<strong>an</strong>zkurven legen aber einen<br />
höheren Anteil l<strong>an</strong>greichweitiger Wechselwirkungen auf der periplasmatischen Seite nahe, so dass<br />
hier noch eine bessere Abschirmung der Oberflächenladung erforderlich sein dürfte.<br />
3.4.2 Rekonstitution<br />
Ein bei der zweidimensionalen Rekonstitution von ScrY auffälliges Phänomen war die Tendenz<br />
zu bidirektionalem Einbau. Unter Umständen besteht hier ein Zusammenh<strong>an</strong>g mit der Tendenz<br />
zur Bildung von Zwillingskristallen bei der 3D-Kristallisation (Forst et al., 1998). Die quasizylindrische<br />
Form des Monomers bietet eine Erklärung für den Umst<strong>an</strong>d, dass die Wechselwirkungen<br />
der Moleküle bei der Kristallisation nicht unbedingt zu einer bevorzugten Orientierung<br />
der Polarität der Trimer-Achsen zuein<strong>an</strong>der führen. Immerhin können durch Variation des LPR<br />
die Protein-Protein-Wechselwirkungen so weit beeinflusst werden, dass der Anteil unidirektionaler<br />
Rekonstitution höher wird. Bidirektionale Rekonstitution zeigte in keinem Fall irgendwelche<br />
Tendenzen zu kristalliner Ordnung.<br />
Daher und aufgrund der Erfordernisse aus der kraftmikroskopischen Untersuchung sollte eine weitere<br />
Optimierung der Rekonstitution von ScrY größere unidirektional gepackte Vesikelfragemente<br />
mit möglichst großen kristallin geordneten Bereichen zum Ziel haben. Unidirektional-kristalline<br />
Bereiche, durchaus beider Orientierungen in demselben Vesikel, waren am ehesten bei einem LPR<br />
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