Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...

GRUNDLAGEN UND METHODEN
7 Datenaufbereitung
eine getrennte Abspeicherung erfolgen (Image - Split Images), danach erfolgt der Export der ursprünglich
als Binary (16 Bit pro Pixel) abgespeicherten Rohdaten (Topographie) in ASCII-Format
(Utility - ASCII-Export). Der Header der Datei kann gleich hier oder später in einem Zeileneditor
entfernt und separat abgespeichert werden. Dieser enthält wichtige Daten über Skalierung
bzw. Scanner-Eichung sowie weitere Aufnahme-Parameter. In SPIDER erfolgt der Import von
ASCII-Datensätzen (Operation CP FROM ASCII), eine Spiegelung an der x-Achse zur Wiederherstellung
der ursprünglichen Orientierung (MI), die Skalierung in nm und die Subtraktion einer
Ebene mit dem Wert des Bildminimums zur Herstellung positiver Pixelwerte (AR). Dies geschieht
alles mit der Prozedur DIconv.sys (oder integriert in Skript b00.*). Dabei muss der axiale Kalibrationswert
des Scanners [ nm ] und der bei der Aufnahme eingestellte maximale Piezohub [V]
V
eingegeben werden (letzterer wird bei der Messung mit 16 Bit Auflösung skaliert).
7.2.2 Selektion von Einzelpartikeln
Neben einer bei der vorliegenden Größe von Datensätzen durchaus noch vertretbaren manuellen
Selektion zu mittelnder Partikel wurden zwei automatisierte Verfahren angewandt:
7.2.2.1 Automatische Partikelauswahl
Zum einen ist das ein Verfahren auf Grundlage einer mit Hilfe texturaler Parameter gewonnenen
„Unterscheidungsfunktion“ (Lata et al. 1995). Dieses erfolgt in drei Phasen, einer vorbereitenden
Phase, einer Trainingsphase und schließlich der automatischen Selektion. In der Vorbereitungsphase
(Batch-Programm b00.*) werden zunächst Partikel einer vorgegebenen Größe ausgesucht.
Dabei wird die Verwendung eines Referenzbildes vermieden, die Suche nach den Objekten erfolgt
unter deren Näherung in Form einer Gaussfunktion passender Breite σ x = d (d: Partikeldurchmesser,
σ x : Standardabweichung Gaussfunktion), und zwar durch vorherige
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Gauss-Tiefpassfilterung
im Fourierraum mit dem entsprechenden Filterradius σ κ = 1 ihrer Transformierten. Die eigentliche
Detektion der Objekte folgt als Suche nach den höchsten Maxima in Umgebungen,
πd
die
jeweils der Partikelgröße entsprechen. - Auf die nach Lata et al. (1995) dem Ganzen noch vorausgehende
Reduktion der Bildgröße/Pixelanzahl konnte aufgrund der geringeren Größe und des
besseren Kontrasts der SFM-Bilder verzichtet werden. - In der folgenden Trainingsphase werden
aus dem ursprünglichen Bild gemäß den Koordinaten der erhaltenen Maxima ausgeschnittene
kleine Datenfenster manuell kategorisiert. Dies erfolgt in „WEB“ (Funktion Command - Categorize,
danach SPIDER-Operation AT IT zur sortierten Speicherung der Ergebnisse in einer Datei).
Dabei wird eine Zuordnung zu den drei Gruppen „Partikel“, „Rauschen“ (entsprechend dem die
Partikel umgebenden Hintergrund) und „Junk“ (für Partikelaggregate, Artefakte etc.), vorgenommen.
Die Eigenschaften der kategorisierten Bildfenster gehen in Form von „Feature-Vektoren“ in
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