Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...

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PROJEKTE UND ERGEBNISSE 2 Substrate, Proteine/Membranpräparationen Abbildung 22: Proteinpräparationen auf Furanpolymer-Substrat, abgebildet in Puffer. A: Collagen (Typ I), aus einer Lösung in PBS bei 4 ◦ C auf Brenzkatechin-FP adsorbiert und in PBS abgebildet. Übersichtsbild (schattiert, aus Topographiedaten) und repräsentatives Höhenprofil eines höher aufgelösten Topographiebilds. B: IgM auf Harnstoff-FP. Die Abmessungen der adsorbierten Partikel sind in den zugehörigen Linienprofilen zu sehen. 85
PROJEKTE UND ERGEBNISSE 2 Substrate, Diskussion 2.5 Diskussion Die Verwendung von Polymersubstraten für rasterkraftmikroskopische Untersuchungen eröffnet ein breites Spektrum von Möglichkeiten, die spezifischen Anforderungen der Immobilisierung verschiedener biologischer Untersuchungsobjekte zu erfüllen. Es konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Polymersubstrate im (Sub-)Nanometer-Maßstab glatt sind und dass sie so beschichtet oder modifiziert werden können, dass ein mechanisch stabiles Substrat für die Kultivierung von Zellen entsteht bzw. die Immobilisierung von Membranpräparationen und isolierten Proteinen möglich wird. Mit einer niedrigen mittleren Oberflächenrauhigkeit (R rms ) von 0.3 - 0.6 nm (PVPK ohne/mit Lamininbeschichtung) und 0.13 - 0.16 nm (Furan-Polymer) ist eine wichtige Grundlage geschaffen, um rasterkraftmikroskopische Untersuchungen auf Zelloberflächen und an Membranpräparationen durchführen zu können. Die dabei erreichte Auflösung ist hoch genug, um eine Visualisierung von Proteinen bzw. Proteinkomplexen in nativen Membranen zu bewerkstelligen. Es wurde gezeigt, dass auf dem Standard-Präparat Purpurmembran die übliche submolekulare Auflösung erreicht wird. Im Gegensatz zu Glas mit einer Polylysin-Laminin-Beschichtung, die üblicherweise für Primärkulturen der empfindlichen Fisch-Oligodendrozyten verwendet wird, ist das lediglich mit Laminin beschichtete PVPK-Substrat im Hinblick auf kraftmikroskopische Untersuchungen mechanisch stabil. Der Verzicht auf Polylysin bedeutet außerdem eine erhebliche Verminderung möglicher Kontaminationen der Sensorspitze. Hier eröffnet sich auch für andere empfindliche Zellsorten, die auf unbeschichtetem Glas oder sonstigen, kommerziell verfügbaren Zellkultursubstraten nicht wachsen, die Möglichkeit, ein sowohl auf die Erfordenisse der Zellkultur als auch auf die kraftmikroskopische Untersuchung der Zellen abgestimmtes Substrat herzustellen. Auf Laminin-beschichtetem Furan-Polymer (Normalrezeptur) zeigten Goldfisch-Oligodendrozyten ebenfalls normale Morphologie und Wachstumsverhalten. Die Abbildung am SFM wurde lediglich dadurch erschwert, dass aufgrund der dunklen Farbe des Polymerfilms die Visualisierung und gezielte Abbildung ausgewählter Zellen erschwert wurde. Aus diesem Grunde sollte dieses Substrat bei Zellen nur Verwendung finden, wenn eine besonders glatte Oberfläche erforderlich ist oder die visuelle Auswahl (z. B. bei einer dicht gewachsenem Kultur) nicht so wesentlich ist. Die Furan-Polymere bieten mit ihren variierbaren Eigenschaften eine echte Alternative zu Glimmer, falls die experimentellen Bedingungen weniger polare oder positiv geladene Oberflächen erfordern. Außerdem sind die Nachteile von Glimmer wie das Quellen in wässriger Lösung, sich ablösende und umherschwimmende Glimmerflocken sowie fehlende Möglichkeiten der chemischen Modifizierung der Oberfläche nicht vorhanden. Bei der Eignung von Modifikationen des Furan-Polymers ist allerdings zu beachten, dass Ko-Monomere unter Umständen die Rauhigkeit des Substrats beeinflussen können. So besitzt insbesondere das Brenzkatechin-modifizierte FP 86
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