Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...

GRUNDLAGEN UND METHODEN
pro Minute in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, das Pellet in Dialysepuffer ohne Azid (bildet
schwerlösliche Niederschläge) resuspendiert und das Ganze nochmal wiederholt. Dann wurden
ca. 10 µl Adsorptionspuffer auf eine frisch gespaltene Glimmerfläche pipettiert. In diesen Puffertropfen
wurde 1 µl Vesikelsuspension gegeben und vorsichtig, ohne den Glimmer mit der Pipette
zu berühren, gemischt. Dieses Mischungsverhältnis musste bisweilen leicht angepasst werden, da
die Vesikelkonzentration von Ansatz zu Ansatz variierte. Der Adsorptionspuffer war in pH und
Ionenstärke an den jeweiligen Dialysepuffer angelehnt, [Mg 2+ ] mindestens auf 20 mM verringert.
Inkubation erfolgte 1 h bei Raumtemperatur (Messlabor), danach wurde mit Messpuffer gespült.
Es wurde auch in Messpuffer angelagert, reproduzierbare Unterschiede zur Adsorption in Anlagerungspuffer
konnten nicht festgestellt werden. Für die Messung musste die Konzentration an
zweiwertigen Ionen drastisch verringert werden. Gute Ergebnisse wurden mit einem Messpuffer
der Zusammensetzung 250 mM LiCl, 2 bis 0 mM MgCl 2 , 20 mM Tris/HCl/pH 7,6 erzielt. Im Lauf
der Untersuchungen wurde die Konzentration von LiCl zwischen 100 und 300 mM variiert, der pH
zwischen pH 6 und pH 8 (MES, HEPES, Tris). Alle Reinigungs-, Adsorptions- und Messpuffer
wurden mit hochreinem Wasser hergestellt.
6 Messungen am SFM
6.1 Vorbereitung der Flüssigkeitsmesszelle
Die Flüssigkeitszellen (Sensorhalterungen) und ihre Bestandteile wurden in Spülmittellösung (in
ddH 2 O) gewaschen, nach längerer Inkubation in der Spüllösung wurde das Gefäß mit der Flüssigkeitszelle
eine bis wenige Minuten in ein Ultraschallbad gehalten. Es wurde hierfür ein Kunststoffbecher
verwendet, da die Wasserzelle für das DI-Multimode aus Glas besteht (Gefahr der Beschädigung).
Danach wurde mehrmals in ddH 2 O gespült, dann in reinem Ethanol (hochrein), wässriger
Ethanollösung und ddH 2 O oder hochreinem Wasser. Bei der Reinigung wurden die Flüssigkeitskanäle
der DI-Wasserzelle mehrmals mit Hilfe einer Pipette durchgespült. Das Fenster-Prisma
der Wasserzelle/Sensorhalterung für den Topometrix-Discoverer wurde nur mit Seifenlauge, nicht
aber mit Alkohol behandelt (Ethanol greift Plexiglas an). Das Fenster für den Mess-Laser wurde
unter einem Binokular auf verbliebene Kontaminationen untersucht, die mit einem alkoholgetränkten
weichen Linsenpapier vorsichtig entfernt wurden (bei dem Plexiglas-Prisma mit Spülmittellösung),
danach wurde die Reinigungsprozedur ggf. nochmal wiederholt.
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