Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...

PROJEKTE UND ERGEBNISSE
3 Sucroseporin, Abbildung am SFM
Abbildung 32: Vergleich Partikelselektion mit Hilfe von Discriminant Analysis bzw. Kreuzkorrelationsfunktion
mit rotationalem Mittel. A: Aufnahme eines Fragments mit bidirektional rekonstituiertem ScrY
(LP R = 0, 2; Lipid: DMPC/POPC (9:1); Messpuffer: 250 mM LiCl, 2 mM MgCl 2 , 20 mM Tris/HCl
pH 7,6; x p = 4, 9 Å). B: Zwischenergebnisse (Mittel) von 4 Iterationen referenzfreien Alignments der
mit Discriminant Analysis ermittelten Partikelserie, C: viertes Mittel (Wertebereich: 10,7 Å) mit Standardabweichungskarte
(Wertebereich: 0,8 - 3,7 Å) und Varianzkarte, N = 19. D: Gefilterte Kreuzkorrelationsfunktion
mit markierten Korrelationsmaxima (schwarze Punkte). E: Rotationales Mittel als Referenz,
F: Zwischenergebnisse von 4 Iterationen referenzfreien Alignments der mittels Korrelationsfunktion selektierten
Partikel, G: viertes Mittel (Wertebereich: 8,3 Å) mit Standardabweichungskarte (Wertebereich: 1,4 -
4,0 Å) und Varianzkarte, N = 85, Maßstab A-G: Kantenlänge Bildfenster B, C, E-G: 12,7 nm. H, I: konturiertes
Mittel (Höhen-Inkrement: 0.5 Å) und SD-Karte vergrößert, Bildfenstergröße: 12,7 nm.
3.3.4 Charakterisierung der periplasmatischen Seite
Bereits bei niedriger Auflösung sind hier distinkte Strukturen erkennbar (Abb. 33), die trotz geringeren
Kontrasts von den oben beschriebenen extrazellulär orientierten Trimeren unterscheidbar
sind. Diese und die beiden weiteren Messungen an demselben Präparat (Abb. 34 und 35) erfolgten
jeweils mit einer Auflagekraft, die einen ausreichenden Konstrast sowohl für die Charakterisierung
der periplasmatisch als auch der extrazellulär orientierten Trimere lieferte (s. oben). Dies,
sowie die Ionenstärke des Messpuffers, sind also noch Kompromissbedingungen, die nicht für die
Abbildung der periplasmatischen Seite optimiert sind (vgl. auch Kraftdistanzkurven Abb. 30).
Abb. 34 zeigt das Ergebnis der Mittelung einer Messung bei höherer Auflösung. Translationales
Alignment und Mittelung (Abb. 34 B-D) lassen deutlicher ein annähernd regelmäßiges Gitter erkennen.
Die Partikel haben im Gitter Abstände von etwa 10 nm zueinander, was mit dem oben bestimmten
Radius des umgekehrt eingebauten Trimers übereinstimmt. Die Standardabweichungskarte
zeigt minimale Werte im Zentrum des Partikels. Erst ein referenzfreies rotationales und
translationales Alignment der so gewonnenen Bildausschnitte um die Partikel (Rohdaten) enthüllt
eine distinktere Struktur der Einzelpartikel (unter Vermeidung der Voreingenommenheit referenzgestützten
Alignments), der „Kristall“ enthält also unterschiedlich um die Trimerenachse rotierte
Moleküle. Die erhaltene sternartige Struktur ist bereits bei anderen Porinen (OmpF, Schabert und
Engel, 1994; Schabert et al., 1995) mit dem SFM gefunden worden und konnte dort eindeutig
den aneinanderliegenden Wänden der drei faßförmigen Monomere (β-Barrels) auf der periplasmatischen
Seite zugeordnet werden. Es handelt sich also um den starren Kernbereich der mit dem
SFM zugänglichen periplasmatischen Seite des ScrY, die drei Poren sind deutlich sichtbar. Die
mittleren mit dem SFM-Sensor gemessenen Höhendifferenzen zwischen erhöhtem Zentrum des
Trimers und Pore betragen im Mittel 3 - 4 Å.
Bei noch höher aufgelöster Messung eines Teilbereichs (Abb. 35) erkennt man bereits nach nur
translationalem Alignment die sternartige periplasmatisch exponierte Struktur des Trimers, hier
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