Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...

ZUSAMMENFASSUNG
Insbesondere bei wohldefinierten, gereinigten Proteinpräparationen ausreichender mechanischer
Stabilität steht mit der Rasterkraftmikroskopie inzwischen eine verlässliche Methode hochauflösender
Abbildung zur Verfügung. In einem zweiten Teilprojekt wurde dies genutzt, um Sucroseporin
aus der Außenmembran des gram-negativen Bakteriums Salmonella typhimurium zu untersuchen.
Hierfür wurde gereinigtes Protein mit Lipiden rekonstituiert und zweidimensional kristallisiert.
Sowohl die zum extrazellulären Medium als auch die zum Periplasma hin exponierten
Oberflächen des Proteins konnten mit submolekularer Auflösung abgebildet werden, mit der
Einschränkung, dass die Abbildung der periplasmatischen Seite durch die hohe Flexibilität des N-
Terminus erschwert wurde. Die Optimierung der Rekonstitution wurde jedoch so weit vorangetrieben,
dass die an den Vesikelfragmenten gemessenen kraftmikroskopischen Daten nach verschiedenen
Verfahren der Einzelpartikelmittelung analysiert werden konnten. Anhand der Rohdaten und
der gemittelten Daten war es möglich, die Topographie der elektrolytexponierten Oberflächen zu
unterscheiden und jeweils Domänen unterschiedlicher Flexibilität zu charakterisieren. Im Fall der
periplasmatischen Seite kam es, je nach Auflagekraft, entweder zu einem dominierenden Einfluss
des flexiblen N-Terminus auf die Abbildung oder aber zur Abbildung des starren β-Barrel-Trimers,
wobei sich der N-Terminus dann nur noch in Form erhöhten Rauschens bemerkbar machte. Dieser
Befund steht in Einklang mit bisherigen Annahmen zu den Abmessungen und Eigenschaften
der flexibel verankerten N-terminalen Coiled-Coil-Struktur. Bei der Abbildung der extrazellulären
Seite konnte der kraftabhängige Beitrag externer Loops an der peripheren Wand des β-Barrels
gezeigt werden.
Insgesamt zeigte sich mit Lipiden rekonstituiertes Sucroseporin einer kraftmikroskopischen Untersuchung
unter quasi-nativen Bedingungen in wässriger Lösung sehr gut zugänglich, was eine
vertiefte Untersuchung mit dieser Methode erfolgversprechend erscheinen lässt. Die bereits erreichte
laterale Auflösung der Größenordnung 2 nm dürfte sich nach weiterer Optimierung der
Rekonstitution problemlos in den üblichen Subnanometer-Bereich steigern lassen.
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in Weiland et al., 1998 (Abstract), Linder et al., 1999,
ferner in Giebel et al., 1999.
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