Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen an nativen biologischen ...

PROJEKTE UND ERGEBNISSE
3 Sucroseporin, Diskussion
von 0,15 bis 0,2 und einem Verhältnis DMPC:POPC von 1:1 zu erhalten und konnten teils aufgrund
knapper Messzeit noch nicht eingehend am SFM untersucht werden. Auf der Grundlage
dieser bisher ermittelten optimalen Rekonstitutionsbedingungen sind weitere Parameter zu variieren:
so können durch Erhöhung der absoluten Proteinkonzentration im Rekonstitutionsansatz
unter Umständen größere Vesikel erzielt werden (Mitteilung L. Hasler). Die Geschwindigkeit der
Entfernung des Detergenz sollte ebenfalls noch optimiert werden. Dies geschieht entweder durch
Variation der Durchflussrate des Puffers in der Dialyseapparatur, hierzu müssten noch genauer
einstellbare Pumpen verwendet werden, oder, bei Verwendung von Dialysebuttons, evtl. durch
zusätzliche Maßnahmen: Beispielsweise kann die Dialysegeschwindigkeit durch Einsatz eines
größeren Puffervolumens, das anfänglich Detergenzpuffer enthält und langsam mit Dialysepuffer
unterschichtet (Rate varriieren) oder durch zusätzliches Rühren gemischt wird, variiert werden.
Eine andere Möglichkeit ist Dialyse mit Buttons in einem größeren Volumen Dialysepuffer ganz
ohne Durchfluss und Rührer. Man kann zwar davon ausgehen, dass die Dialysebedingungen in der
Durchflussapparatur besser kontrollierbar und damit reproduzierbarer sind, Buttons haben jedoch
den Vorteil, dass kein Unterdruck wie bei Durchflusszellen entsteht sowie nicht notwendigerweise
ein maximaler Konzentrationsgradient des Detergenz über die Membran vorliegt. Damit kann der
Übergangszeitraum, in dem gemischte Mizellen und Bilayer koexistieren (Dolder et al., 1996; Hasler
et al, 1998), beliebig verlängert werden. Die gängige Vorstellung der noch wenig verstandenen
Prozesse der Rekonstitution und zweidimensionalen Kristallisation besteht nämlich darin, dass die
Schlüsselereignisse in diesem Übergangsbereich stattfinden: durch graduelle Absenkung der Detergenzkonzentration
kommt es bei Erreichen eines Werts der Konzentration an freiem Detergenz
nahe dessen kritischer Mizellenkonzentration zur Aggregation der gemischten Lipid-Detergenzund
Protein-Detergenz-Mizellen bzw. zu Protein-Lipid- und Protein-Protein-Wechselwirkungen.
Bei passender Balance dieser Wechselwirkungen erfolgt der Einbau des Proteins in einen Lipid-
Bilayer (Jap et al., 1992). Das LPR muss dabei so groß sein, dass amorphe Aggregation von
Protein verhindert wird (der Lipid-Bilayer hält die Proteinmoleküle in einer Ebene), andererseits
darf es nicht so groß sein, dass die für die Bildung von Kristallkontakten nötigen Protein-Protein-
Wechselwirkungen unterbunden werden. Für letztere ist auch die Temperatur bedeutend, die sowohl
die Stärke hydrophober Wechselwirkungen der Proteinmoleküle untereinander als auch deren
zweidimensionale Diffusionsrate im Bilayer beeinflusst (Kühlbrandt, 1992). Zumindest eine Variation
von T max der Rekonstitution ist daher durchaus noch eine sinnvolle Möglichkeit, diese
Vorgänge zu beeinflussen. Die Vorstellung hingegen, man könnte durch mehrphasige Temperaturprofile
während der Rekonstitution und damit mehrmaliges Durchlaufen der Phasenumwandlung
flüssig-quasikristallin die Proteine aus der quasikristallinen Phase des Lipids austreiben und so in
Bereichen geringerer Lipidkonzentration in eine dichtgepackte und zunehmend kristalline Packung
zwingen (Jap et al., 1992), hat sich eher nicht bestätigt (vgl. auch Engel und Hefti, zit. in Hasler et
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