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Kapitel 4: Reduktion von 2,5-Diketo-D-Gluconat zu 2-Keto-L-Gulonat
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ihr Gen auf dem klonierten Plasmid in umgekehrter Leserichtung vorliegt (vgl.
Abbildung 4.6). Zudem ist die spezifische Aktivität der FDH für gewöhnlich kleiner, so
dass man selbst bei gleicher Expression weniger biomassenspezifische Aktivität findet.
Ob die Aktivität der FDH in den E. coli-Zellen für eine Ganzzell-Biotransformation
ausreicht, wurde im Satzreaktor überprüft. Frisch geerntete und induzierte E. coli BL21
DE3 wurden mit Na-Formiat- und 2,5-DKG-Lösung versetzt und für drei Stunden bei
25°C gerührt. Bei einigen Ansätzen wurden die Zellen zuvor mit einprozentiger CTAB-
Lösung permeabilisiert. Auch wurde in einigen Fällen Cofaktor zugegeben (NAD + oder
NADH).
7
Konzentration 2-KLG / mM
6
5
4
3
2
1
permeabilisierte Zellen, Zugabe 1 mM NADH
unpermeabilisierte Zellen, keine Cofaktorzugabe
permeabiliserte Zellen, keine Cofaktorzugabe
permeabilisierte Zellen, Zugabe 0,4 mM NAD
0
0 50 100 150 200
Zeit / min
Abbildung 4.8: Biotransformation im Satzreaktor mit E. coli BL21 DE3 pDrive_dkgr_fdh. Bedingungen:
7,4 mM 2,5-DKG, 50 mM Na-Formiat, 50 mM KP i -Puffer pH6,4, 25°C, 10 g/L E. coli, V=30 mL.
Permeabilisierung: 1 % CTAB-Lösung, 25°C, 1h.
Wie Abbildung 4.8 zeigt, produzieren unpermeabilisierte Zellen kein 2-KLG –
vermutlich, weil E. coli-Zellen keinen Transporter für das Substrat 2,5-DKG besitzen
und intakte Zellen diese Substanz daher nicht aufnehmen können. Dieses Phänomen
wurde bereits zuvor beschrieben: Yum et al. fanden, dass einige E. coli-Stämme das
Enzym 2,5-DKGR zwar exprimieren, das Substrat jedoch nicht als Kohlenstoffquelle
nutzen können – die Autoren vermuteten, dass die Zellen Schwierigkeiten haben, die
Verbindung in die Zelle aufzunehmen [Yum et al. 1999].
Permeabilisierte Zellen können 2-KLG produzieren – jedoch nur, wenn zusätzlich
ausreichend Cofaktor zur Lösung hinzugegeben wird. Der Grund: Bei der
Permeabilisierung wird die Membranintegrität gestört und die Konzentration der
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