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Kapitel 8: Materialien und Methoden
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Sämtliche Medienbestandteile, mit Ausnahme von Glucose und Cefoxitin, in bidest
H 2 O wurden direkt im 30 L-Fermenter (Chemap) sterilisiert. Anschließend wurde sterile
Glucoselösung und 1,8 L Inokulum aus Schüttelkolbenkulturen hinzugefügt. Cefoxitin
wurde in wässriger Lösung durch einen Sterilfilter hinzugegeben.
Der Sauerstoffpartialdruck wurde mittels Elektrode permanent überwacht und durch
Begasung mit steriler Luft, Anpassen der Rührerdrehzahl und Erhöhung des Fermenterinnendrucks
auf bis zu 1,2 bar konstant bei 30% gehalten. Der pH-Wert der Kultur
wurde durch die Zugabe von 25%igem Ammoniak zwischen 5,8 und 6 gehalten. Die
Temperatur lag konstant bei 30°C.
Ab einer Kultivierungsdauer von etwa vier Stunden wurde sterile Glucoselösung der
Stammkonzentration 500g Glucose /L mittels Schlauchpumpe zudosiert. Die Zulaufrate
wurde derart angepasst, dass die Glucosekonzentration im Medium 10 mmol/L nicht
überstieg. Im Anschluß an die Fermentation wurden die Zellen bei 8000 UpM (Avanti
J-20XP, Rotor JLA-8.1000, Beckman Coulter) zentrifugiert und anschließend zweimal
mit 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Nach Aliquotierung wurden die Zellen bei
-20°C gelagert.
8.6.4.2 Fermentation von E. coli BL21 DE3 pQE 82L_dkgr
Die Vorgehensweise bei der Fermentation des rekombinanten E. coli-Stammes
BL21 DE3 pQE 82L_dkgr ist ausführlich in Kap. 8.8 (Isolierung des Enzyms 2,5-
Diketogluconatreduktase) beschrieben.
8.6.4.3 Fermentation von E. coli BL21 DE3 pDrive_dkgr_fdh und
DH5 pDrive_dkgr_fdh
Der E. coli-Stamm BL21 DE3 wurde vor der Fermentation mit dem Plasmid
pDrive_dkgr_fdh transformiert; die Kultivierung des Stammes DH5 pDrive_dkgr_fdh
erfolgte direkt aus der entsprechenden Glycerinkultur.
Von den beiden rekombinanten E. coli-Stämmen wurde jeweils eine 50 mL-Vorkultur
in 250 mL-Schüttelkolben in LB-Medium (Tabelle 8.8, zusätzlich 0,25 g/L Glucose) bei
33 °C und 180 rpm über Nacht angefertigt. Aus diesen Übernachtkulturen wurden je
zwei 200 mL LB-Kulturen in 1-L-Kolben angeimpft. Diese wurden bei 180 rpm und
37°C inkubiert, bis eine OD600 von 0,7 erreicht war. Die Kulturen wurden mit
0,1 mM IPTG induziert und für weitere 15 Stunden bei 25°C und 180 UpM inkubiert.
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