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Kapitel 8: Materialien und Methoden
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wurde eine starke Anionenaustauschersäule mit N + (CH 3 ) 3 -Funktion (HiPrep 16/10 QFF,
GE Healthcare) und einem Säulenvolumen von 20 mL. Die genaue Methode beschreibt
Tabelle 8.17.
Tabelle 8.17: Methode zur Enzymaufreinigung über FPLC-Ionenaustauschchromatographie
(CV = Säulenvolumina)
Säule
HiPrep 16/10 QFF (GE Healthcare)
Puffer A 20mM Bis-Tris-HCl pH 6,5
Puffer B 20mM Bis-Tris-HCl pH 6,5
500 mM NaCl
Gradient
(1) Äquilibrierung
(2) Injektion
(3) Waschschritt
(4) Gradient 1
(5) Elution 1
(6) Gradient 2
(7) Elution 2
0,7 CV
1 CV
0,5 CV
2,5 CV
3,7 CV
2,5 CV
2,3 CV
Flussrate 1 mL/min (2, 3)
2,5 ml/min (1, 4-7)
Injektionsvolumen
20 mL
Temperatur
Raumtemperatur
100 % A
100 % A
0 % 40 % B
40 % B
40 % 100 % B
100 % B
Anschließend wurden die enzymhaltigen FPLC-Fraktionen vereint, in einer
Ultrafiltrationszelle auf 20 mM KP i -Puffer (pH 6,4) umgepuffert und lyophilisiert.
8.9. Aktivitäts- und Stabilitätsbestimmung von
Biokatalysatoren
8.9.1 Bestimmung der Aktivität von G. oxydans-Zellen
Die Aktivitätsbestimmung von Gluconobacter oxydans-Zellen erfolgte in einer eigens
dafür konstruierten Apparatur, in der eine ausreichende Versorgung der Zellen mit
Sauerstoff gewährleistet war. Den genauen Aufbau zeigt Abbildung 8.5: Ein 50-mL-
Mantelkolben (4) wurde über ein Wasserbad (mgw Lauda) auf die gewünschte
Temperatur gebracht, in einigen Fällen wurde der pH-Wert der Lösung über eine
pH-Elektrode (Nordantec) gemessen und mit Hilfe eines Dosimaten (Metrohm) mit 1 M
KOH-Lösung und 0,1 N Salzsäure auf dem eingestellten pH-Wert gehalten.
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