View - JUWEL - Forschungszentrum Jülich

8.5. Analytische Methoden
______________________________________________________________________
Tabelle 8.3: HPLC-Methode für die Reaktion Glucose 2,5-Diketo-D-Gluconat
HPLC-Säulen
HPLC-Vorsäulen
Säulentemperatur 55°C
Eluent 5 mN H 2 SO 4
Flussrate
Wellenlänge
Injektionsvolumen
Rezex ROA Organic Acid H + 8μ (Phenomenex)
1. 50 x 7,8 mm 2. 300 x 7,8 mm
=> Ionenausschlusssäule, Material: sulfoniertes Styren-
Divinylbenzol-Harz, ionische H + -Form
Security Guard Kartuschen Carbo-H: 4 x 3,0 (mm)
(Phenomenex)
Isokratisch, 0,4 mL/min
210 nm
10 μL
Obwohl nicht vollständig basisliniengetrennt, können die einzelnen Keto-Gluconsäuren
hinreichend gut quantifiziert werden. Lediglich die ermittelten Gluconatkonzentrationen
am Ende einer Biotransformation im Satzreaktor sind mit relativ hohen Fehlern
behaftet, da hier regelmäßig Störpeaks auftreten (nicht gezeigt). Die Retentionszeiten
der einzelnen Verbindungen zeigt Tabelle 8.4.
Tabelle 8.4: Retentionszeiten der relevanten Substanzen
auf Rezex ROA Organic Acid H + [min]
2,5-DKG 14,1
2-KG 15,2
5-KG 16,0
Gluconat 17,0
Da Glucose im UV-Bereich nicht aktiv ist, konnte es mit dieser Methode nicht
quantifiziert werden. Seine Konzentrationsbestimmung beschreibt Kapitel 8.5.2.
8.5.1.2 Reduktionsreaktion von 2,5-DKG zur 2-Keto-L-Gulonsäure
Hierfür wurde eine HPLC-Kieselgel-Säule mit Aminofunktion unter sauren Bedingungen
verwendet. Die genaue Methode beschreibt Tabelle 8.5. Mit dieser Methode
wurden alle Keto-Gluconsäuren vollständig basisliniengetrennt. Die Luna-NH 2 -Säule
besitzt unter den angewendeten Trennbedingungen jedoch nur eine sehr geringe
Lebensdauer. Deshalb kam sie nicht zur Untersuchung der Reaktion Glucose 2,5-
DKG zum Einsatz.
166