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8.8. Isolierung des Enzyms 2,5-Diketogluconatreduktase
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Tabelle 8.15: Modifiziertes LB-Medium zur
Kultivierung von BL21DE3 pQE82L_dkgr
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
MgSO 4
NaH 2 PO 4
Glucose
pH 7,2 mit NaOH
5 g/L
2,5 g/L
2,5 g/L
0,25 g/L
1,26 g/L
3 g/L
8.8.2 Enzymisolierung über Affinitätschromatographie
8.8.2.1 Zellaufschluss
Die benötigte Menge an Zellen aus den Fermentationen wurde bei 4°C aufgetaut und als
30 %ige Suspension in Lysispuffer (Tabelle 8.16) resuspendiert.
Tabelle 8.16: Zusammensetzung der verschiedenen Puffer zur Isolierung der 2,5-DKGR
Lysispuffer Waschpuffer Elutionspuffer
K 2 HPO 4 [mM] 19,34 19,34 19,34
KH 2 PO 4 [mM] 30,66 30,66 30,66
NaCl [mM] 300 300 300
Imidazol [mM] 10 20-50 250
pH 7
Der Aufschluß erfolgte bei 4°C über Ultraschall.
Erfolgte die Aufreinigung im kleinen Maßstab über eine Säule, wurden 200 mL
Zellsuspension zunächst mit einer Spatelspitze Lysozym bei 4°C gerührt und
dann in einem Eisbad-gekühlten Sonifier-Gefäß über dreimal fünf Minuten
ultrabeschallt, mit je fünf Minuten Pause zwischen den Beschallungsphasen.
Bei einer Aufreinigung im großen Maßstab über das Satzverfahren erfolgte der
Zellaufschluss in einer 30 mL-Durchlaufzelle, durch die die Zellsuspension mit
einem Volumenstrom von 2 mL/min gepumpt wurde. Die Beschallung erfolgte
zyklisch mit jeweils 8 Sekunden Beschallung und 4 Sekunden Pause.
Vorlagegefäß, Durchlaufzelle und Auffanggefäß wurden ständig über einen
Doppelmantel auf 2 °C gekühlt.
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