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Kapitel 4: Reduktion von 2,5-Diketo-D-Gluconat zu 2-Keto-L-Gulonat
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Enzym empfindlich auf leichte Variationen im Aufreinigungsverfahren (andere
Pumpgeschwindigkeiten, Art und Länge der Ultrabeschallung, u.ä.).
Tabelle 4.2: Isolierte Fraktionen I-IX der 2,5-DKGR (Säulenverfahren)
Fraktion
Masse
Zellen
[g]
Masse
Lyophilisat
[g]
Proteinanteil
[%]
Masse
Protein
[mg]
Aktivität
(20°C, 15,8 mM
2,5-DKG)
[U/mg Protein ]
U
Gesamt
I 52,0 0,59 3,0 17,4 2,57 57,3
II 42,0 0,52 1,9 9,8 8,25 148,7
III 42,0 0,53 1,4 7,6 1,43 16,3
IV 50,0 0,70 1,2 8,4 2,48 32,8
V 41,3 0,38 1,2 4,7 6,32 44,8
VII 49,0 0,22 0,5 1,2 1,73 3,6
IX 51,5 0,42 0,6 2,4 8,35 18,0
Gesamt 327,8 3,36 51,5 321,5
Insgesamt wurden 51,5 mg Protein isoliert, mit einer Gesamtaktivität von 322 U. Das
Säulenverfahren eignet sich demnach dazu, relativ sauberes und aktives Enzym zu
isolieren. Jedoch nimmt das Verfahren sehr viel Zeit in Anspruch und es können in
einem Lauf nur geringe Mengen Enzym aufgereinigt werden, da die Kapazität der Säule
begrenzt ist.
4.3.2.2 Satzverfahren
Daniel Minör hat in seiner Diplomarbeit ein Satzverfahren entwickelt, mit dem schnell
große Mengen des Enzyms Enterokinase über die Ni-Affinitätschromatographie
aufgereinigt werden konnten [Minör 2007]. Dieses Verfahren wurde jetzt auch für das
Enzym 2,5-DKGR angewendet.
Dabei befand sich das Ni-IDA-Harz in einer Plexiglasschale mit Nylonnetz am Boden,
was einen schnellen Pufferwechsel erlaubte. In Abschnitt 8.8.2.3 ist das Satzverfahren
detailliert beschrieben. Das Satzverfahren erlaubte es, den Zellüberstand von bis zu
150 g Zellen gleichzeitig zu behandeln (im Säulenverfahren: 50 g). Dabei dauert das
Satzverfahren insgesamt nur etwa drei Stunden (Säulenverfahren: ca. fünf Stunden)
Abbildung 4.14 zeigt ein SDS-Gel der Enzymfraktionen, die im Satzverfahren isoliert
wurden.
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