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4.3. Gewinnung der 2,5-Diketo-D-Gluconatreduktase in reiner Form
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Abbildung 4.13: Fraktionen I-IX der 2,5-DKGR, isoliert über das Säulenverfahren.
SDS-Gel, 4-12 % Bis-Tris, Silberfärbung.
Eine Ausnahme macht Enzymfraktion I: Sie ist stark mit Fremdproteinen verunreinigt.
Der Grund: Der Waschpuffer enthielt hier nur 20 mM Imidazol, bei allen weiteren
Aufreinigungen lag die Konzentration bei 50 mM. Zu wenig Imidazol im Waschpuffer
begünstigt die unspezifische Bindung von Proteinen an das Ni-IDA-Harz und führen zu
einer Verunreinigung der resultierenden Enzymlösung.
Von allen Enzymfraktionen wurde die Aktivität bestimmt; dafür wurden Lösungen aus
der Biotransformation mit G. oxydans verwendet (Kapitel 3). Die Konzentration an
2,5-DKG wurde jeweils per HPLC bestimmt, anschließend wurden die Lösungen auf
die 2,5-DKG-Konzentration verdünnt, bei denen das Enzym maximale Aktivität zeigt
(siehe 4.6.1). Die Enzymaktivität wurde über den Umsatz an NADPH und der Abnahme
der Absorption bei 340 nm im Photometer bei 20°C und pH 6,4 bestimmt. Aufgrund der
Schwierigkeit, reines 2,5-DKG zu isolieren oder zu kaufen, ist eine ähnliche
Vorgehensweise auch in anderen Arbeiten beschrieben [Banta et al. 2002a].
Tabelle 4.2 zeigt, dass die Aktivität des Enzyms in den einzelnen Fraktionen zwischen
1,4 und 8,4 U/mg Protein schwankt. Dass die Aktivität der Fraktion I relativ gering ist,
verwundert nicht; immerhin enthält sie viele Proteinverunreinigungen, die die Proteinmenge
erhöhen und die spezifische Enzymaktivität rechnerisch reduzieren. Doch auch
die Fraktionen III, IV und VII zeigen nur relativ geringe Enzymaktivitäten, obwohl sie
laut SDS-Gel so gut wie frei von Verunreinigungen sind. Vermutlich reagiert das
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