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Kapitel 8: Materialien und Methoden
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Tabelle 8.12: Zusammensetzung SOC-Medium
SOC-Medium
Trypton
20 g/L
Hefeextrakt
5 g/L
NaCl
10 g/L
KCl
0,2 g/L
+ 1 % einer 1 M MgCl 2 /MgSO 4 -Stammlösung
+ 2 % einer 18 %igen (w/v) Glucose-Lösung
8.7. Gentechnische Arbeiten
8.7.1 Isolierung von DNA
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus rekombinanten E. coli-Zellen erfolgte mit den
Lösungen und Anionentauschersäulen des QIAprep Spin Miniprep-Kits (Qiagen) aus
5 mL-LB-Übernachtkulturen nach Angaben des Herstellers.
Zur Isolierung von DNA-Molekülfragmenten nach einer Spaltung mit einem
Restriktionsenzym wurden diese zunächst durch Agarose-Gelelektrophorese
aufgetrennt. Die entsprechenden Banden wurden unter UV-Licht mit einem Skalpell
eng ausgeschnitten. Die Isolierung der DNA aus dem Gel erfolgte mit dem QIAquick
Gel Extraction Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers.
8.7.2 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Mit Hilfe des Programms Clone Manager (Sci-Ed Central) wurden die für die
jeweiligen Schnittstellen benötigten Restriktionsendonukleasen ermittelt. Die Spaltung
erfolgte bei 37 °C und 300 UpM über vier Stunden im einfach konzentrierten Puffer des
Herstellers (Puffer A, Roche). Die 20 μL Ansätze waren so gewählt, dass jeweils 5 U
Restriktionsenzym und 1 μg Plasmid-DNA vorlagen.
8.7.3 Ligation von DNA-Fragmenten
Für die kovalente Verknüpfung geeigneter DNA-Moleküle wurde die Ligase des
Phagen T4 (Roche) eingesetzt. Vom Hersteller mitgelieferter Ligasepuffer, Insert-DNA,
Vektor-DNA und das 0,1fache Volumen T4-Ligase wurden in einem 10 μL-
Reaktionsansatz gemischt. Dabei wurden jeweils zwei verschiedene Ligationsansätze
mit verschiedenen molaren Vektor:Insert-Verhältnissen gewählt (Vektor:Insert 25:4 und
5:2). Die Ligation erfolgte über 16 Stunden bei 16 °C.
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