View - JUWEL - Forschungszentrum Jülich

Kapitel 1: Einleitung
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Es wurden Versuche unternommen, den Prozess durch eine Co-Immobilisierung auf
eine einzige Biotransformation zu reduzieren: Aiguo und Peiji co-immobilisierten
Zellen von Gluconobacter oxydans und Corynebacterium sp. in einem Calciumalginat-
Gel und nutzten sie für eine Produktion von 2-KLG in einem Schritt. Mit Gluconat als
Startmaterial erreichten sie dabei im Schüttelkolben jedoch lediglich Ausbeuten von
38% [Aiguo et al. 1998].
1.2.3.2 Einstufige Synthese mit genetisch veränderten
Mikroorganismen
1985 wurde erstmals ein genetisch veränderter Bakterienstamm vorgestellt, der Glucose
direkt zu 2-KLG umsetzte [Anderson et al. 1985]. Das Gen für das Enzym 2,5-Diketo-
D-Gluconatreduktase (2,5-DKGR) aus Corynebacterium war dafür in Erwinia herbicola
exprimiert worden. Erwinia herbicola setzt natürlicherweise Glucose zu 2,5-DKG um;
der rekombinante Organismus konnte dieses Zwischenprodukt anschließend mit Hilfe
der 2,5-DKGR zu 2-KLG reduzieren. Die Gesamtausbeute lag bei 22,4%. Grund für die
geringe Ausbeute war nach Angaben der Autoren die unterschiedlichen Wirkorte der
Enzyme: Membrangebundene Enzyme oxidieren Glucose im Periplasma der Zelle, die
2,5-DKGR liegt hingegen im Zytoplasma vor. 2,5-DKG muss somit vom Periplasma ins
Zytosol transportiert werden, um zu 2-KLG reduziert zu werden.
Grindley et al. gelang es 1988, durch Transformation von Erwinia citreus auf dieselbe
Weise die Ausbeute auf 49,4 % zu steigern [Grindley et al. 1988]. Erwinia citreus
wächst im Gegensatz zu Erwinia herbicola weder in 2,5-DKG- noch 2-KLG-haltigen
Medien. Somit werden weder Produkt noch Zwischenprodukt anderweitig verbraucht.
Auch ein optimiertes Fermentationsprotokoll und die Auswahl der richtigen Promoter
hatten die Ausbeute verbessert. Jedoch wirke weiterhin die Aufnahme von 2,5-DKG in
die Zelle limitierend, so die Autoren. Auch die Bereitstellung von Cofaktor sei ein
Problem: Das Enzym 2,5-DKGR benötigt NADPH als Cofaktor, welches stets in
ausreichender Menge im Zytosol vorhanden sein muss.
Bei einem 2,5-DKG-reduzierenden Mikroorganismus der Gattung Pantoea citrea
überexprimierten Valle et al. das Transporterprotein, welches 2,5-DKG in die Zelle
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