View - JUWEL - Forschungszentrum Jülich
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8.6. Allgemeine mikrobiologische Arbeiten<br />
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Anschließend erfolgte die Zellernte mittels Zentrifugation. Die Zellen wurden bis zur<br />
weiteren Verwendung in 0,9%iger NaCl-Lösung bei 4°C gelagert.<br />
8.6.5 Permeabilisierung von E. coli-Zellen<br />
Zu permeabilisierende E. coli-Zellen wurden in wässriger 1%iger CTAB-Lösung<br />
resuspendiert. Mit Hilfe eines Thermomixers (Eppendorf) wurden die Zelllösungen bei<br />
Raumtemperatur für eine Stunde bei 600 UpM gut durchmischt. Die Zellen wurden<br />
anschließend zentrifugiert und erneut in Puffer aufgenommen.<br />
8.6.6 Herstellung Calcium-kompetenter E. coli-Zellen<br />
E. coli-Zellen wurden durch Behandlung mit einer Calciumchlorid-Lösung chemisch<br />
kompetent gemacht. Dazu wurden 100 mL LB-Medium (Tabelle 8.8) mit E. coli-Zellen<br />
aus einer Übernachtkultur angeimpft und bis zum Erreichen einer Zelldichte von OD 600<br />
= 0,6 bei 37°C und 180 UpM inkubiert. Die Zellen wurden bei 4°C für 20 Minuten bei<br />
4200 UpM in 50 mL-Falcon Tubes zentrifugiert (Multifuge 3 S-R, Heraeus). Die<br />
Bakterienpellets wurden in 25 mL eiskalter Magnesiumchloridlösung (0,1 M)<br />
resuspendiert, für 5 Minuten auf Eis gelagert und erneut zentrifugiert. Nach<br />
Resuspension in 5 mL eiskalter Calciumchloridlösung (0,1 M) wurden die Zellen 20<br />
Minuten auf Eis gelagert und zentrifugiert. Das Pellet wurde zuletzt in 1 mL 0,1 M<br />
Calciumchloridlösung mit 14 %igem Glycerinanteil aufgenommen, in 100 μL-Aliquots<br />
in vorgekühlte Eppis verteilt und für eine spätere Transformation bei -80°C gelagert.<br />
8.6.7 Transformation von Mikroorganismen<br />
Durch eine Transformation werden Plasmide in E. coli-Zellen übertragen.<br />
Zu 100 μl kompetenten E. coli-Zellen wurden zwischen 2 und 5 μL Plasmid-DNA<br />
pipettiert und 50 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock bei 42°C für 90<br />
Sekunden wurde der Ansatz 5 Minuten auf Eis inkubiert, mit 400 μLsterilem SOC-<br />
Medium (Tabelle 8.12) versetzt und eine Stunde bei 37°C und 350 UpM (Thermomixer,<br />
Eppendorf) geschüttelt. Der Ansatz wurde auf LB-Agarplatten mit entsprechendem<br />
Antibiotikum ausgebracht und über Nacht bei 37°C im Brutschrank gelagert.<br />
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