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396COMUNICAZIONI LIBEREAnalysis of genomic low copy number DNAfrom cells harvested by laser-microdissectionG. Giuffrè, L. Saravo * , D. Di Martino * , N. Staiti * , A. Simone,P. Todaro, G. TuccariDepartment of Human Pathology, University of Messina; *Laboratory of Molecular Biology, Raggruppamento CarabinieriInvestigazioni Scientifiche, MessinaIntroductionTissue microdissection techniques, allowing a correlation betweenthe topologic organization of the cells and the molecularanalysis of nucleic acid extracted, represent a key techniquein molecular pathology. In fact, the presence of a widespectrum of cell types in tissue samples may complicate theanalysis of a particular cellular population. Laser-assistedmicrodissection is an advanced procedure to cut small tissuefragments as well as single cells by an ultraviolet laser beamin order to select a specific cell population of interest from aheterogeneous sample, under direct microscopic visualization.In the present report we evaluate the sensitivity of thismethod in order to perform genomic analysis from low copynumber DNA.MethodsLaser-microdissection was performed using a Leica ASLMD system (Leica Microsystems, Germany) on smears ofaploid (spermatozoa) and diploid (cervical) cells, on sectionsof tissues routinely formalin-fixed and paraffin-embedded,on cryostatic sections obtained at surgery and postfixedwith cold acetone or methanol. The samples werestained with specific procedures (Haematoxilin-Eosin,Methylene blue, Papanicolau, Picroindigocarmine-Nuclearfast red). For each sample, an increasing number of cellsfrom 1 to 100 was harvested in different PCR tubes. DNAextraction was performed by Chelex 100 (Biorad), QI-Amp DNA Micro Kit (Qiagen) and DNA IQ System(Promega Corp.). The DNA extracted from each samplewas amplified to identify a specific genetic profile by themost common microsatellite loci (BAT25, BAT26, BAT40,D2S123, D5S346, D17S250) as well as multiple Short TandemRepeat (STR) typing (AmpFLSTR Identifiler, PEBiosystems) of forensic interest. PCR products were separatedby capillary electrophoresis with 3100 AB Prism GeneticAnalyzer; and analyzed by the Genescan and GenotyperSoftwares v 3.7.ResultsWe have obtained sufficient DNA for amplification and STRtyping starting from 10 aploid cells while amplification formicrosatellite loci was achieved with 5 diploid cells obtainedfrom routinely processed tissue samples. Moreover, not doall the staining procedures seem to be equally respectful towardsintegrity of the extracted DNA.ConclusionsThe documented possibility to perform a genomic analysis oflow copy number DNA from few cells harvested by laser microdissectionrepresent a valid aid in order to solve diagnosticand forensic problems in medical practice.Valutazione dei recettori deimineralcorticoidi in spermatozoi umanimediante citofluorimetria eradioreceptorassayC. Fiore * , D. Sticchi, S. Masiero * , G.P. Rossi ** , I. Karbowiak,G. Bonanni, D. Armanini, S. Forzan***, A. Fassina***Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche, Endocrinologia;* Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale,Clinica Medica 4; *** Dipartimento di Scienze Oncologiche eChirurgiche, Sezione di Anatomia Patologica, Università diPadova; ** Laboratorio di Analisi, Ospedale Piove di Sacco,PadovaIntroduzioneL’aldosterone (A) è stato considerato recentemente uno deiprincipali promotori dello stress ossidativo. L’A agisce legandosial suo recettore localizzato non solo a livello dei tessutibersaglio, ma anche in altri sedi non considerate target di A.Lo stress ossidativo sugli spermatozoi sembra agire a vari livellicon compromissione di motilità e fertilità, anche se nonè stata ancora evidenziata una possibile correlazione con A.Scopo dello studio è evidenziare la presenza di recettori deimineralcorticoidi (MR) in spermatozoi umani e valutare lapossibile azione di A in tali cellule.MetodiAbbiamo analizzato campioni di liquido seminale provenientida sei soggetti volontari, sani (25-35 anni). Gli spermatozoisono stati isolati mediante centrifugazione su gradientediscontinuo di Percoll. Per l’analisi citofluorimetrica di MRabbiamo utilizzato un anticorpo specifico policlonale anti-recettoreA (MINREC4). Una parte degli spermatozi è statapre-trattata con metanolo, per permeabilizzarne la membrana.Per gli esperimenti di radioreceptor assay abbiamo isolatogli spermatozoi e li abbiamo incubati con A marcato a dosidecrescenti, da solo o con aggiunta di un eccesso di A freddo.In tutti i campioni è stato aggiunto un glucocorticoide puroper escludere il legame di A al recettore dei glucocorticoidi.I risultati sono stati espressi mediante analisi Scatchard.Un’aliquota di sperma è stata fissata con formalina 10% perl’immunoistochimica (ICC).RisultatiIn citofluorimetria abbiamo rilevato che gli spermatozoi nontrattati con metanolo mostravano solo una debole fluorescenza(27%), mentre gli spermatozoi pre-trattati con metanolodavano una fluorescenza di alta intensità nel 98% degli spermatozoiincubati con anticorpo primario e secondario. I risultatidimostrano, dunque, che lo spermatozoo possiede i recettoridei mineralcorticoidi e che essi sono intracellulari.Dagli esperimenti di radioreceptorassay risulta che il valoremedio di MR per singolo spermatozoo è di 250+105 recettoriper cellula e l’affinità 2,1 ± 0,4 nmol/L. L’analisi ICC haconfermato la presenza di recettori MR.ConclusioniMR sono presenti negli spermatozoi umani normali e la lorodeterminazione risulta agevole e ripetibile con le tecniche dianalisi radiorecettoriale, citofluorimetrica e ICC. Nei prossimistudi valuteremo l’effetto dell’aldosterone in vitro sullaespressione proteica di geni coinvolti nello stress ossidativo,in particolare il p22 phox ed il PAI-1 e la confronteremo con levarie situazioni patologiche che possono interessare il testicolo.