Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

82 A. Fluoreszenzeigenschaften von GFP Polyproteinen
Abbildung A.8: Kalibration einer Größenausschluss-Chromatographiesäule: Molekulargewicht in
Einheiten des GFP Molekulargewichts (26.4 kDa) als Funktion des Elutionsvolumens. Die grünen
Balken zeigen Fraktionen an, deren Fluoreszenz in Einzelmolekül-Experimenten analysiert worden
ist (vgl. Anhang A).
1.2 MDa ist die Ausschlussgröße der Säule erreicht, d.h Moleküle dieser Größe treten entweder
gar nicht erst in die Säule ein oder werden ohne Verzögerung durchgeleitet. Mit der
Kalibration kann das Absorptionssignal einer Proteinlösung als Funktion des Elutionsvolumens
durch eine Chromatographiesäule direkt in ein Absorptionssignal als Funktion des
Molekulargewichtes umgerechnet werden. Handelt es sich um Polyproteine, ist die Molekulargewichtsangabe
proportional zur Länge der Polyproteine. Wird das Absorptionssignal
bei einem bestimmten Elutionsvolumen durch die entsprechende Polyproteinlänge geteilt,
erhält man somit eine zur molekularen Konzentration eines Polyproteins bestimmter Länge
proportionale Angabe.
Abb. A.9 a) und b) zeigen die typische Längendispersion der konstruierten GFP Polyproteine
am Beispiel einer (3,212) veknüpften GFP Polyproteinlösung. Die Graphen wurden
anhand der Absorption der Proteinlösung als Funktion des Elutionsvolumen bei drei
verschiedenen Wellenlängen: 280 nm, 396 nm und 473 nm bestimmt. Abb.A.9 a) zeigt den
Bereich kleiner und Abb. A.9 b) den Bereich sehr großer Längen. Die Kurven sind zum
besseren Vergleich auf eine Konzentration von 1 für GFP Monomere normiert worden. Alle
drei Signale zeigen die Präsenz von GFP Polyproteinen bis zu Molekülen, die etwa hundert
Untereinheiten umfassen. Die Absorption von Licht der Wellenlänge 280 nm einer Proteinlösung
wird verursacht durch den Gehalt an den Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan
und ist direkt proportional zum absoluten Proteingehalt und weitgehend unempfindlich
gegenüber dem Faltungszustand von Proteinen. GFP Moleküle mit fertig ausgebildetem
Chromophor weisen zusätzlich zwei Absorptionsbanden auf, eine bei 396 nm und eine bei
473 nm. Dabei absorbiert GFP etwa 3 mal stärker bei 396 nm als bei 473 nm. Aggregation
bzw. Denaturierung des GFP kann zu einer Veränderung des Absorptionsverhältnisses
führen [108][109]. Für Abb. A.9 c) sind die Quotienten aus den Absorptionskurven gebildet