Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

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72 A. Fluoreszenzeigenschaften von GFP Polyproteinen Abbildung A.1: a) Anregungspektren von nicht-mutierten (wt-) GFP und (3,212) GFP Polyproteinlösungen. Beobachtet wird die Emission bei 508 nm. b)-c) Emissionsspektren bei Anregung mit 396 nm bzw. 473 nm Wellenlänge. d) Anregungsspektren von eGFP und (3,132) eGFP Polyproteinlösungen. Beobachtet wird die Emission bei 508 nm. e)-f) Emissionsspektren bei Anregung mit 396 nm bzw. 473 nm Wellenlänge. daher einen permanenten anionischen Zustand des Chromophores. Ersetzt man Serin durch Threonin, so bleibt die Restgruppe von Glu 222 neutral und das Chromophor besetzt permanent den anionischen Zustand [79]. Diese GFP Variante ist unter dem Namen Enhanced GFP (eGFP) in der Literatur bekannt. Zum weiteren Test ist daher das vorhandene native GFP und zwei der Zweifach-Cystein mutierten GFP Varianten, (3,132) und (132,212), durch Durchführung der Punktmutation S65T zu eGFP umgearbeitet worden. Abb. A.1 d)-f) zeigen Anregungs- und Emissionspektren von eGFP und (3,132) verknüpften eGFP Polyproteinen. (132, 212) GFP Polyproteine zeigen identisches Verhalten. Auch hier ist wieder vollständige Übereinstimmung mit den spektralen Eigenschaften des nicht mutiertem eGFP zu beobachten. Die leichte Verschiebung der Emissionsspektren zu größeren Wellenlängen ist auf die 2 nm große Unsicherheit in der mechanischen Einstellung der Beugungsgitter des verwendeten Spektrometers zurückzuführen. Die Spektren zeigen direkt, dass die verschiedenen Ladungsszustände des Chromophores, die sensibel von der korrekten Position bestimmter Restgruppen in der Raumstruktur des GFP abhängen, auch in Zweifach-Cystein mutierten GFP Polyproteinen kontrolliert werden können. Es ist damit gesichert, dass alle vorgenommenen Zweifach-Cystein Mutationen zu kor-
A.2 Fluoreszenz einzelner GFP Polyproteine verschiedener Länge 73 rekt gefalteten und funktionalen GFP Molekülen führen, deren Raumstruktur vollständig mit der des nativen GFP übereinstimmt. Der Polymerisationszustand einer GFP Polyproteinlösung hat dabei keinen Einfluss auf die spektralen Eigenschaften der Proteinlösung. A.2 Fluoreszenz einzelner GFP Polyproteine verschiedener Länge Das GFP bietet aufgrund seiner Fluoreszenz die Möglichkeit, eine Untersuchung der Funktionalität von GFP Polyproteinen ebenfalls auf der Einzelmolekülebene durchzuführen. Es ist denkbar, dass ein Teil der Moleküle in einem Polyprotein ihre Funktionalität verliert und damit nicht über spektrale Eigenschaften in einer Ensemblemessung erfassbar ist. Es ist daher von Interesse, ausgehend von GFP Monomeren, die Fluoreszenzeigenschaften von GFP Polyproteinen zu analysieren. Für die folgenden Analysen ist daher ein invertiertes objective-type Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskop konstruiert worden (vgl. Anhang D.1). Für die Anregung stand Laserlicht der Wellenlänge 473 nm zur Verfügung. Aufgrund der verbesserten Anregbarkeit von eGFP im Vergleich zu GFP bei 473 nm (vgl. Abb. A.1) sind die folgenden Messungen mit eGFP Polyproteinen durchgeführt worden. Mit Größenausschluss-Chromatographie sind Lösungen mit eGFP-Polyproteinen verschiedener Länge präpariert worden. Es sind sechs verschiedene Längenbereiche aufgereinigt worden (grüne senkrechte Balken in Abb. A.8). Laut Säulenkalibration handelt es sich dabei um Monomer-, Dimer-, Tetramer-, Nonamer-, und 16-mer Fraktionen und eine Fraktion, die Moleküle unbekannter Länge aus dem Bereich der Ausschlussgröße der Säule enthält. Die Längenangaben der beiden letztgenannten Fraktionen sind fragwürdig, da die Auftrennungscharakteristik der verwendeten Chromatographiesäule in diesem Größenbereich unsicher ist. Die Fraktionen wurden auf etwa 1 · 10 −10 M Proteinkonzentration verdünnt und nacheinander unter exakt den gleichen Anregungsbedingungen nach Adsorption auf die Oberfläche eines Deckgläschens unter Anregung durch Laserlicht bei 473 nm in totaler interner Reflektion im Fluoreszenzmikroskop untersucht. Abb. A.2 zeigt typische Fluoreszenzbilder der verschiedenen Größenfraktionen, a) zeigt die Monomere, b) die Dimere, c) die Tetramere, d) die Nonamere, e) die 16-mere und f) Moleküle unbekannter Länge. Die Kamera des Mikroskops nimmt Einzelbilder auf, die digitalisiert als zweidimensionaler Intensitätsdatensatz vorliegen. Da Helligkeiten in Bildern vom Betrachter nur schwer evaluiert werden können, sind die Bilder der verschiedenen Fraktionen als dreidimensionale Landschaft dargestellt. Die Höhen sind dabei direkt proportional zur Fluoreszenzintensität pro 25 ms Belichtungszeit, wobei die Intensitätsskala für alle Bilder in Abb. A.2 identisch ist. Die ausgeprägten Peaks in diesen Bildern werden durch einzelne, stationäre Leuchtpunkte verursacht. Aufgrund der hochrein präparierten Probenoberfläche und Lösungen sind die Leuchtpunkte auf oberflächen-immobilisierte eGFP Moleküle zurückzuführen. Die sehr schmalen und flachen Peaks werden durch transiente Moleküle, Streulicht und elektronisches Rauschen verursacht. Es ist klar zu erkennen, dass die absolute Fluoreszenzintensität der Leuchtpunkte von Bild zu Bild zunimmt. Die Peaks in Bild b) haben in etwa
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